王煜蘅，張　婷，吳昌學，李　毅，官志忠,2，齊曉嵐△

(貴州醫(yī)科大學：1.分子生物學重點實驗室；2.病理學教研室，貴陽 550004)

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燃煤污染型地方性氟中毒患者血細胞hMLH1與MGMT mRNA表達改變*

王煜蘅1，張婷1，吳昌學1，李毅1，官志忠1,2，齊曉嵐1△

(貴州醫(yī)科大學：1.分子生物學重點實驗室；2.病理學教研室，貴陽 550004)

目的探討燃煤污染型地方性氟中毒(簡稱燃煤型地氟病)對血液中錯配修復(fù)基因(hMLH1)及O(6)-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MGMT)mRNA表達水平的影響。方法在貴州省畢節(jié)地區(qū)燃煤型地氟病區(qū)抽取45例患者，按其氟斑牙和氟骨癥嚴重程度分為輕、中、重度組各15例。在畢節(jié)地區(qū)非病區(qū)抽取15名村民作為對照組。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組血樣本MGMT、hMLH1 mRNA水平。結(jié)果燃煤型氟中毒輕、中、重度3個組中hMLH1及MGMT mRNA水平與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著氟中毒程度的加重，其降低程度更加明顯。組間兩兩比較，隨著中毒程度加重，表達水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論MGMT與hMLH1 mRNA水平在燃煤型氟中毒所造成的DNA損傷及修復(fù)機制中可能有負面作用。

O(6)-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；錯配修復(fù)基因；氟中毒

燃煤污染型地方性氟中毒(簡稱燃煤型地氟病)指居民長期在室內(nèi)使用無排煙道的土爐灶燃燒含氟量較高的煤用于取暖、做飯、烘干糧食和蔬菜等，導(dǎo)致體內(nèi)長期攝入過量氟所引起的全身損害性疾病[1]。燃煤型地氟病患者除了表現(xiàn)有典型的氟骨癥和氟斑牙特征外，還可表現(xiàn)其他系統(tǒng)和器官的病理改變。近年來有關(guān)氟對基因改變和DNA損傷已經(jīng)引起了較大的關(guān)注[2]，研究表明氟在一定劑量條件下，可引起肝細胞、生殖細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞等DNA發(fā)生損傷。如果DNA損傷能夠得到正確的修復(fù)，則不會發(fā)生DNA的突變，而如果修復(fù)發(fā)生錯誤或沒有啟動DNA的修復(fù)過程，會誘導(dǎo)DNA突變。因此，DNA損傷與修復(fù)之間的平衡決定了DNA是否發(fā)生改變及其程度。對于氟所誘導(dǎo)DNA損傷的增強，主要原因之一是氟既誘導(dǎo)了DNA損傷，同時也損害了DNA修復(fù)系統(tǒng)[3]。

錯配修復(fù)基因(hMLH1)及O(6)-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MGMT)是DNA修復(fù)系統(tǒng)中的兩個重要基因，本研究采用實時熒光定量PCR的方法對氟病區(qū)患者的血液樣本hMLH1及MGMT mRNA水平進行檢測，研究其是否與氟中毒病患嚴重程度有關(guān)。

1　資料與方法

1.1一般資料在貴州省典型燃煤型地氟病區(qū)畢節(jié)市進行樣本抽取，選取八寨鎮(zhèn)毛栗坪村45例燃煤型地氟病患者為氟病組，平均年齡為(50.0±12.6)歲，按Dean氏分類法對氟病區(qū)居民氟斑牙程度進行分級，氟骨癥診斷按GB16396-1996進行分類，《地方性氟骨癥臨床分度診斷》(GB16396-1996)的診斷依據(jù)和分度原則為： 生活在地方性氟中毒病區(qū)的人群，因氟攝入過量，引起慢性中毒，X線片發(fā)現(xiàn)有氟骨癥征象時，方可診斷為地方性氟骨癥，并按分度標準加以分度，結(jié)合病區(qū)人群氟斑牙與氟骨癥嚴重程度分為輕、中、重度組。同時，在貴州省非燃煤型地氟病區(qū)貴陽市沙文鎮(zhèn)新寨村，選取年齡性別平衡的15名健康人群作為對照組，平均年齡為(50.4±14.2)歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器Trizol (Invitrogen，美國)，氯仿、異丙醇、SYBR Green(Roche,德國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)，DU640 核酸蛋白分析儀，ABI Step one 型Real-time PCR儀。

1.2.2MGMT及hMLH1 mRNA水平的測定在知情同意的情況下，抽取患者靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，分離血細胞，采用經(jīng)典Trizol一步法提取血液總RNA，檢測RNA濃度以及純度。A260/A280比值在1.9～2.1表示無蛋白或DNA影響，為可用RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取3 μg血液總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計并合成MGMT及hMLH1和內(nèi)參β-actin熒光定量PCR引物，引物序列見表1。運用ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀收集MGMT及hMLH1基因及內(nèi)參照β-actin擴增循環(huán)的熒光信號，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s；60℃ 60 s，40個循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以Applied Biosystems SDS2.1軟件進行熒光收集和數(shù)據(jù)分析。SDS2.1軟件分析其△△Ct值和RQ(relative quantity)值(RQ=2-△△Ct)。以β-actin為內(nèi)參照分析結(jié)果，并計算各組MGMT及hMLH1 mRNA相對表達水平。實驗重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔。

表1　　MGMT及hMLH1的引物序列

1.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件。統(tǒng)計采用單因素方差分析，方差齊性檢驗采用Levene法，方差齊則用LSD法，方差不齊則用Dunnett-t3法檢驗，以P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　　果

2.1各組氟斑牙以及氟骨癥分度情況輕度氟病組氟斑牙分度情況如下，0度1例，1度14例；中度氟病組1度2例，2度13例；重度氟病組3度15例。輕度氟病組氟骨癥分度情況如下，0度1例，1度14例；中度氟病組2度15例；重度氟病組2度2例，3度13例。

2.2組間MGMT mRNA表達水平比較在輕、中、重度氟病組中，MGMT mRNA水平與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著氟中毒程度加重，MGMT水平降低更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組MGMT mRNA表達水平比較見圖1。

2.2組間hMLH1 mRNA 表達水平比較在輕、中及重度氟病組中hMLH1 mRNA表達水平與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隨著氟中毒程度加重，hMLH1 mRNA水平降低程度更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組hMLH1 mRNA表達水平比較見圖2。

A:表達水平；B：溶解曲線；C：擴增曲線；a:P<0.05，與對照組比較。

圖1各組MGMT mRNA表達水平

A:表達水平；B：溶解曲線；C：擴增曲線；a:P<0.05，與對照組比較。

圖2各組hMLH1 mRNA表達水平

3　討　　論

氟是人類生命活動中必需的微量元素之一，適當氟的攝入，有助于骨骼和牙齒的正常發(fā)育，有利于神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)等。最早，人們只是發(fā)現(xiàn)氟與一些地區(qū)居民的牙齒斑釉的流行有潛在關(guān)聯(lián)，后來，隨著研究的不斷深入，超過一定劑量的氟不僅會對牙齒造成傷害，還會對骨骼造成損傷，同時，對肝腎及神經(jīng)系統(tǒng)的研究也證實了氟的非骨相損傷。隨著氟研究的深入，氟化物的致癌性及致突變性日益得到重視，尤其是致突變性更成為研究熱點[4]。在細胞增殖過程中，DNA損傷是比較常見的一種現(xiàn)象，遺傳信息完整穩(wěn)定遺傳則需依賴于DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。人體內(nèi)存在DNA 損傷修復(fù)系統(tǒng)，能夠及時有效地修復(fù)DNA的損傷，以確保DNA的準確復(fù)制及基因組的穩(wěn)定性[5]。

通過對氟中毒動物模型及人群的研究顯示，氟可以誘導(dǎo)DNA損傷，影響與細胞凋亡相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[6-7]。如果DNA修復(fù)系統(tǒng)正常，剛不會引起DNA的突變，反之，則可導(dǎo)致DNA的損傷甚至突變發(fā)生。氟對機體的損傷除骨相損傷外，也有非骨相損傷，這些損傷的發(fā)生可能是氟在直接造成DNA損傷的同時，也影響了DNA修復(fù)系統(tǒng)。因此，本實驗針對DNA修復(fù)相關(guān)基因進行研究，探討氟是否會影響DNA修復(fù)系統(tǒng)。

DNA錯配修復(fù)(MMR)系統(tǒng)是DNA復(fù)制后的一種修復(fù)機制，能夠特異性識別并修復(fù)錯配堿基，具有維持基因復(fù)制保真度、維持基因組穩(wěn)定及降低DNA自發(fā)突變的功能[8-10]?，F(xiàn)從人體共分離到9個MMR基因，分別編碼不同的MMR蛋白[8]。當MMR系統(tǒng)出現(xiàn)異常時，不能修復(fù)DNA復(fù)制中出現(xiàn)的堿基錯配時，會引起DNA突變率的增加，而產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性。MGMT與DNA烷基化損傷的修復(fù)密切相關(guān)，能修復(fù)O6-甲基鳥嘌呤即烷化基團對細胞 DNA的損傷，在 DNA損傷修復(fù)的早期發(fā)揮了重要的作用[11]。因此MGMT正常表達是機體細胞能夠維持基因組DNA穩(wěn)定性，修復(fù)DNA烷化損害的關(guān)鍵酶。有研究表明，MGMT表達低下與其啟動子區(qū)異常甲基化有關(guān)，后續(xù)實驗可對此進行進一步探索。hMLH1能夠消除DNA復(fù)制過程中由于DNA聚合酶滑移而引起堿基-堿基錯配和插入缺失突環(huán)的形成。

由于有研究表明過量氟會造成DNA損傷，本實驗以此為基礎(chǔ)選取修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)基因進行研究，結(jié)果顯示染氟組MGMT、hMLH1 mRNA表達量與對照組相比均有所下降，且下降程度與氟中毒的嚴重程度成正比，說明過量氟可抑制MGMT、hMLH1的表達，可能對機體的DNA修復(fù)系統(tǒng)造成了一定的損害，導(dǎo)致DNA損傷無法正常修復(fù)。

氟引起DNA損傷的機制比較復(fù)雜，可能是多因素共同作用的結(jié)果，而研究DNA損傷修復(fù)基因與氟引起DNA損傷之間的關(guān)系對損傷機制的猜想有一定的意義。同時對深入研究氟引起DNA損傷的機制有一定的參考作用。

[1]官志忠.關(guān)注地方性氟中毒發(fā)病機制研究的重要性和熱點問題[J].中華地方病學雜志,2014,33(2):119-120.

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The effect of endemic fluorosis caused by coal burning on the expression of hMLH1 and MGMT mRNA*

WangYiheng1,ZhangTing1,WuChangxue1,LiYi1,GuanZhizhong1,2,QiXiaolan1△

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology;2.DepartmentofPathology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo discuss the impact of endemic fluorosis caused by coal burning on the DNA repair gene human mismatch repair gene(hMLH1) and O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT) mRNA level in blood.MethodsForty-five villagers selected from Bijie area of Guizhou Province were divided into three groups as the low-dose fluoride group,the middle-dose fluoride group,the high-dose fluoride group based on the severity of dental and skeletal fluorosis,and each group with 15 cases.Fifteen villagers from the non-fluorosis area of Bijie area were selected as control group.The MGMT and hMLH1 mRNA were quantitated with the real-time quantitative PCR technology.ResultsThe mRNA expression level of MGMT,MLH1 mRNA from the patients in fluorosis region decreased compared to control group(P<0.05),and had a positive correlation with the severity of fluorosis,which was significantly different in group comparison(P<0.05).ConclusionThe reduction of MGMT and hMLH1 mRNA may play an important role in the mechanism of DNA injury and repair,which may be related to DNA damage arose from fluoride caused by coal burning.

O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase；mismatch repair gene；fluorosis

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.012

國家科技支撐計劃項目(2013BAI05B03)；國家自然科學基金資助項目(81160335)；貴州省科技廳重點項目[黔科合計Z 字(2012)4010]；貴州省科技計劃課題(國際合作項目)資助[黔科合外G字(2011)7014號]。作者簡介：王煜蘅(1988-)，碩士，主要從事燃煤型氟中毒的研究。△

，Tel:13885158277；E-mail:xiaolan76@163.com。

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A

1671-8348(2016)24-3348-03

2016-02-11

2016-05-04)