黃　忠，湯慶莉，吳天祥，朱思潔，楊祖滔

超聲波提取灰樹花菌絲體蛋白工藝優(yōu)化

黃忠，湯慶莉*，吳天祥，朱思潔，楊祖滔

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

為了獲得提取率高的灰樹花菌絲體蛋白，以灰樹花菌絲體為原料，采用超聲波提取灰樹花菌絲體蛋白。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計，以蛋白提取率為評價指標，對提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取條件為液料比95∶1（mL∶g），超聲功率600 W，超聲溫度35℃，超聲時間3 min，pH 10.5，在該條件下，灰樹花菌絲體蛋白提取率為（5.10±0.04）%。

灰樹花；菌絲體蛋白；超聲波；提取；優(yōu)化

灰樹花（Grifola frondosa）俗稱“栗子蘑”，又名貝葉多孔菌、蓮花菌等，隸屬于擔子菌綱、多孔菌目?；覙浠ㄗ訉嶓w肉質(zhì)柔軟，營養(yǎng)豐富，是一種高檔珍稀食用菌，同時灰樹花還是一種十分珍貴的藥用真菌［1-2］?；覙浠ㄖ械幕瘜W成分主要包括多糖、蛋白質(zhì)、核酸、多酚等，除多糖外，灰樹花中含量較高的另一種功能性成分是蛋白質(zhì)，灰樹花蛋白中含有多種對人體有利的氨基酸，其必需氨基酸中異亮氨酸含量較高，有助于蛋白質(zhì)的合成；還含有較高的谷氨酸和天冬氨酸，這兩種氨基酸具有保護人腦神經(jīng)以及抗機體疲勞的作用［3-4］。

目前研究表明，真菌蛋白已表現(xiàn)出顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤抑制活性［5］。GU C Q等［6］從灰樹花中提取的小分子蛋白具有抗單純孢疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus-Ⅰ，HSV-Ⅰ）的作用。TSAO Y W等［7］研究表明，灰樹花蛋白具有刺激小鼠自然殺傷樹突狀細胞和增強小鼠抗腫瘤免疫。陳寧等［8］從灰樹花子實體中經(jīng)分離純化得到的具有熱穩(wěn)定性的灰樹花蛋白，能夠抑制煙草花葉病毒。NANBA H等［9］最早發(fā)現(xiàn)了灰樹花中的抗腫瘤多糖，其組分中含有的1%～20%的蛋白可能具有獨特作用。

國內(nèi)對灰樹花菌絲體蛋白的提取工藝鮮有報道。真菌蛋白的提取方法一般采用的堿提法或水浸提法，但耗時長而且效率較低［10-13］；為提高提取效率和縮短提取時間，本實驗采用超聲波提取灰樹花菌絲體蛋白，通過單因素試驗及正交試驗對提取條件進行優(yōu)化，以期為灰樹花菌絲體蛋白的進一步深入地研究提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

灰樹花（Grifola frondosa）菌株（菌種編號51616）：中國微生物菌種保藏管理中心；考馬斯亮藍G-250（分析純）、牛血清蛋白（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；KH2PO4（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；酵母膏（分析純）、蛋白胨（分析純）：上海盛思生化科技有限公司；MgSO4·7H2O（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；其余試劑均為市售分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO42 g/L，pH自然。

1.2儀器與設備

BXM-30R型立式滅菌鍋、GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；UV-7502PC型紫外可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；SW-CJ-1D型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SG8200HPT型超聲波清洗機：上海冠特超聲儀器有限公司；TG2-16G型低速離心機：上海安亭科學儀器廠；CP114型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1灰樹花菌絲體的培養(yǎng)方法

斜面種子培養(yǎng)：切取母種試管中黃豆大小的菌絲塊，接種于PDA斜面培養(yǎng)基中部，放置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌絲長滿整個斜面。

液體種子培養(yǎng)：取蠶豆大小的斜面菌種，接種到裝液量為100 mL/250 mL的液體種子培養(yǎng)基中，一支種子管接種一瓶。于25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7～9 d，待液體種子培養(yǎng)基中長出大量均勻、細小的菌絲球且發(fā)酵液清亮［14］。

發(fā)酵培養(yǎng)：用移液槍吸取種子液10 mL，接種于裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中。于25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7～9 d［15］。

1.3.2牛血清蛋白標準曲線的繪制

參照文獻［16］，采用考馬斯亮藍染料比色法，精確稱取10 mg牛血清蛋白標準品，加入100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容，得到0.1 mg/mL的牛血清蛋白標準液，分別取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別向試管中加入配制好的考馬斯亮藍G-250溶液5 mL，搖勻，避光反應5～10 min后，在波長595 nm處測定其吸光度值，繪制牛血清蛋白標準曲線。

1.3.3樣品制備及其蛋白的提取

將灰樹花發(fā)酵菌絲體用紗布過濾，然后用蒸餾水反復清洗5次，得到的灰樹花濕菌絲體置于60℃干燥箱中干燥約12 h至恒質(zhì)量，用研缽研磨成粉末放入干燥器中備用；稱取一定質(zhì)量的灰樹花菌絲體粉末于離心管中，加入適當比例的蒸餾水后用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調(diào)至所需pH后，放入超聲波清洗器中在一定溫度和時間下提取，提取液經(jīng)4 000 r/min離心20 min，上清液即為樣品溶液。取0.1 mL上清液于具塞試管中，按照繪制標準曲線的方法，測定蛋白質(zhì)的吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算蛋白含量。菌絲體蛋白提取率計算公式如下：

式中：Y表示蛋白提取率，%；m1表示上清液中蛋白質(zhì)量，mg；m2表示灰樹花菌絲體干粉質(zhì)量，mg。

1.3.4單因素試驗

經(jīng)過前期多次的預實驗，發(fā)現(xiàn)在超聲波清洗機功率的變化范圍內(nèi)，提高超聲功率可以增大灰樹花蛋白的提取率，縮短提取時間，因此選擇在最大的超聲功率（600 W）條件下，考察超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、超聲時間（1 min、5 min、15 min、30 min、60 min）、pH（7、8、9、10、11）、液料比（60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1（mL∶g））對灰樹花菌絲體蛋白提取率的影響。

1.3.5正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，為了得到灰樹花菌絲體蛋白提取的最佳工藝條件，以超聲溫度、超聲時間、液料比、pH為考察因素，以灰樹花菌絲體蛋白提取率（Y）為評價指標，采用L9（34）正交設計對灰樹花菌絲體蛋白提取條件進行優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表1。

表1　菌絲體蛋白提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for mycelium protein extraction process optimization

2　結(jié)果與分析

2.1牛血清蛋白標準曲線的制作

在波長595 nm處測量不同質(zhì)量濃度的牛血清蛋白的吸光度值，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制牛血清蛋白標準曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，標準曲線回歸方程式為y=8.740 5x+0.009 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，表明牛血清蛋白質(zhì)量濃度和吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1　牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1超聲溫度對灰樹花蛋白提取率的影響

在超聲時間為5 min、液料比為80∶1（mL∶g）、pH值為9.0條件下，考察超聲溫度對灰樹花菌絲體蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　超聲溫度對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of protein

由圖2可知，在超聲溫度30～70℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的增加，蛋白提取率呈先增加后降低的趨勢。在超聲溫度為40℃時，蛋白提取率達到最大值，為4.77%。這可能由于溫度過高導致部分蛋白質(zhì)變性失活而降解，因此，選擇超聲溫度40℃為宜。

2.2.2超聲時間對灰樹花蛋白提取率的影響

在超聲溫度為40℃、液料比為80∶1（mL∶g）、pH為9.0的條件下，考察超聲時間對菌絲體蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3　超聲時間對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of protein

由圖3可知，在超聲時間為5 min時，蛋白提取率達到最大值，為4.24%；繼續(xù)增加超聲時間，蛋白提取率開始緩慢降低，這可能由于持續(xù)強烈的振動效應和空化效應使得部分蛋白結(jié)構(gòu)斷裂而破壞，降低了提取率，因此，選擇超聲時間5 min為宜。

2.2.3 pH對灰樹花蛋白提取率的影響

在液料比為80∶1（mL∶g）、超聲時間為5 min、超聲溫度為40℃條件下，調(diào)pH至7、8、9、10、11，考察pH值對灰樹花菌絲體蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，pH值在7～11范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，蛋白提取率也逐漸增加。當pH值為10時，蛋白提取率為4.77%，繼續(xù)增加pH值蛋白提取率基本保持穩(wěn)定。由于堿性太強會使氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔?，從而影響提取出的蛋白質(zhì)量。因此，選擇pH 10為宜。

圖4　pH對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of protein

2.2.4液料比對灰樹花蛋白提取率的影響

在超聲溫度為40℃、超聲時間為5 min、pH為10.0條件下，考察液料比對灰樹花蛋白提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5　液料比對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of liquid-material ratio on the extraction rate of protein

由圖5可知，增加液料比會促進蛋白質(zhì)的溶解，當液料比為90∶1（mL∶g）時，蛋白提取率達到最大值，為4.54%；繼續(xù)增加液料比，蛋白提取率開始緩慢下降，因此，選擇液料比90∶1（mL∶g）為宜。

2.3正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，設計正交試驗因素水平表，采用L9（34）的正交試驗設計，進行3次平行試驗，正交試驗結(jié)果與分析如表2所示，方差分析如表3所示。

由表2中R值可知，用超聲波提取灰樹花菌絲體蛋白時，蛋白提取率影響程度大小依次為pH（C）＞液料比（D）＞超聲溫度（B）＞超聲時間（A）。最優(yōu)水平組合為A1B1C3D3，即超聲溫度35℃，超聲時間3 min，液料比95∶1（mL∶g），pH 10.5。由表3可知，pH和液料比對蛋白提取率有顯著性影響（P＜0.05），超聲時間和超聲溫度對蛋白提取率影響不顯著。在最優(yōu)工藝參數(shù)條件下，進行3次平行實驗，測得灰樹花蛋白提取率為（5.10±0.04）%。正交試驗結(jié)果可靠。該提取工藝提取時間短、提取溫度低、減少了能源消耗。

表2　菌絲體蛋白提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mycelium protein extraction process optimization

表3　正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3　結(jié)論

本實驗采用超聲波提取灰樹花菌絲體蛋白，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗得到提取灰樹花菌絲體蛋白的最佳工藝條件，即超聲溫度35℃，超聲時間3 min，液料比95∶1（mL∶g），pH 10.5，工藝參數(shù)影響程度大小依次為pH＞液料比＞超聲溫度＞超聲時間，在此條件下，灰樹花菌絲體蛋白平均提取率可達（5.10±0.04）%。該方法操作簡便，提取效果好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。為深入地研究灰樹花蛋白的生理活性及其理化性質(zhì)提供理論基礎。

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Optimization of extraction technology of protein fromGrifola frondosamycelium by ultrasonic wave

HUANG Zhong，TANG Qingli*，WU Tiangxiang，ZHU Sijie，YANG Zutao
（College of of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to obtain high extraction rate of protein fromGrifola frondosamycelium，theG.frondosamycelium protein was extracted by ultrasonic wave with theG.frondosamycelium as raw material.On the basis of single factor experiments，with the extraction rate of protein as the evaluation index，the extraction processing was optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum extraction conditions were liquid-material ratio 95∶1（ml∶g），ultrasonic power 600 W，ultrasonic temperature 35℃，ultrasonic time 3 min and pH 10.5.Under the conditions，the protein extraction rate was（5.10±0.04）%.

Grifola frondosa；mycelium protein；ultrasonic wave；extraction；optimization

TS202.3

0254-5071（2016）07-0151-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.033

2016-03-31

國家自然科學基金資助項目（31460537）

黃忠（1992-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

湯慶莉（1967-）女，副教授，本科，研究方向為食品生物技術(shù)。