宋　娟，胡生海，李明澤，張霽紅

蘋果醋優(yōu)勢醋酸菌株的誘變選育

宋娟，胡生海，李明澤，張霽紅

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

以酒精含量為7%vol的蘋果酒發(fā)酵醪液為馴化介質(zhì)，對引進(jìn)的醋酸桿菌20056進(jìn)行馴化與誘變選育。采用紫外誘變的方法，確定最佳誘變條件為誘變時間40 s、誘變距離40 cm、菌液稀釋度10-5，此時細(xì)胞致死率為82.15%。15株誘變菌株通過誘變效應(yīng)、產(chǎn)酸實驗、定性實驗等驗證，結(jié)果表明經(jīng)過初步篩選的UV-3、UV-6、UV-11三株正突變菌株，產(chǎn)酸總量分別和誘變前的原菌株相比分別提高了20.45%、23.73%、24.61%，乙醇脫氫酶活性的峰值分別是原菌株的2.7、3.5、3.7倍。紫外誘變有效的提高了蘋果酒發(fā)酵醪液中的酒精轉(zhuǎn)化力，為優(yōu)勢醋酸菌的選育提供了簡便、有效的育種手段。

蘋果醋；醋酸菌；馴化；誘變選育

近年來，隨著人們生活水平的提高，果醋及果醋飲料越來越受到消費者的青睞。蘋果醋是一種成本較低、營養(yǎng)價值高、風(fēng)味優(yōu)良的酸性調(diào)味品和飲料保健品［1］，特別具有抗真菌特性，改善口腔炎癥［2］，預(yù)防高血脂癥［3］、抑制雙糖酶活動、延緩胃排空［4］、增加飽腹感［5］、減輕糖尿病、控制體質(zhì)量［6］等功效。目前果醋主要的生產(chǎn)方法是液態(tài)深層發(fā)酵法，此法對醋酸菌活力要求較高，目前生產(chǎn)上使用較多的有食醋醋曲、惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens）、巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）、巴氏亞種（滬釀1.01）［7］等，但這些菌株普遍存在易退化、活性低、產(chǎn)酸率低及產(chǎn)品風(fēng)味不佳等問題［8-9］。優(yōu)良醋酸菌株具有產(chǎn)酸率高、發(fā)酵能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點，通過檢測乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性指標(biāo)，不但可以感知菌株的發(fā)酵能力和產(chǎn)酸速率，而且能夠?qū)崟r監(jiān)控產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味。通常采用傳統(tǒng)的馴化、誘變育種、雜交育種和現(xiàn)代的原生質(zhì)體融合技術(shù)，以及基因工程育種等選育手段，而馴化、誘變育種是最普遍、最經(jīng)濟(jì)實用的育種手段［10］。雖然人們對利用遺傳學(xué)方法獲得優(yōu)良菌株有極大的興趣，但生產(chǎn)中獲得的工業(yè)菌株并不多。本實驗在引進(jìn)菌株馴化研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展誘變研究，采用紫外誘變方法從誘變時間、誘變距離、菌液稀釋濃度等影響因素的選擇到誘變菌株的初篩、復(fù)篩及產(chǎn)酸性能、乙醇脫氫酶活性等實驗，為優(yōu)勢醋酸菌的選育提供了簡便、有效的育種途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

醋酸菌CICC20056：中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，無水乙醇3%，pH 4.5。

分離培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入瓊脂2%，碳酸鈣2%，無水乙醇3%。

斜面保藏培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入瓊脂2%，碳酸鈣1%，無水乙醇3%。

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后加入7%無水乙醇，裝液量50 mL/250 mL。

各培養(yǎng)基121℃高壓滅菌30 min，待溫度降至60～70℃時加入碳酸鈣（便于測量菌落透明圈），備用。

1.1.3試劑

氫氧化鈉（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖：上海廣諾化學(xué)科技有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂：上海致化化學(xué)科技有限公司；無水乙醇、碳酸鈣、酚酞、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、Trition X-100、FeCl3：天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺、ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16MC冷凍離心機(jī)：長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；KQ-200VDB超聲波清洗器：上海昆山超聲儀器有限公司；S25-2恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；UV2400紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌株誘變和篩選流程

菌源制備→擴(kuò)大培養(yǎng)→紫外線誘變→產(chǎn)醋酸定性實驗→菌株初篩→菌株復(fù)篩→產(chǎn)酸測定、乙醇脫氫酶活測定

1.3.2紫外線誘變方法［11］

（1）制備菌懸液：取培養(yǎng)48 h的5支斜面保藏醋酸菌20056，用無菌生理鹽水將菌苔沖洗完全，3 000 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，以便將菌塊打碎。菌液離心15 min，制成菌懸液待用（細(xì)胞濃度調(diào)整為108個/mL）。

（2）紫外線處理

現(xiàn)代育種理論認(rèn)為，被誘變的微生物致死率在80%左右時，產(chǎn)量性狀的正突變率較高［12］。

①不同照射時間紫外線處理：打開紫外線燈開關(guān)，預(yù)熱約20 min，取無菌平皿（直徑6 cm）6套，分別加入已制備的菌懸液3mL，并在平皿中放入無菌攪拌棒。設(shè)置紫外照射距離為40 cm，分別攪拌照射10 s、20 s、30 s、40 s，50 s、60 s，同時做空白對照（菌懸液3 mL，不需要紫外照射，下同）。

②不同照射距離紫外線處理：操作同上，紫外線照射時間為40s，分別設(shè)置照射距離為30cm、35cm、40cm、45cm、50 cm，同時做空白對照。

③不同菌液濃度紫外線處理：操作同上，紫外線照射時間為40 s，距離為40 cm，菌液濃度（108個/mL）分別稀釋10-4、10-5、10-6、10-7四個梯度，同時做空白對照。

（3）稀釋、涂板、計數(shù)：采用10倍稀釋法，分別取10-4、10-5、10-6、10-7四個稀釋度進(jìn)行涂平板，每組3個重復(fù)。用黑布避光培養(yǎng)，72 h取出平板進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，根據(jù)對照平板上菌落數(shù)，計算出每毫升菌液中的活菌數(shù)，計算細(xì)胞致死率。

（4）觀察誘變效應(yīng)：分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算其比值（HC值），并選取HC比值大的菌落進(jìn)行培養(yǎng)和實驗。

1.3.3產(chǎn)酸定性實驗

將上述斜面保藏菌種分別接種于體積分?jǐn)?shù)3%乙醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于30℃條件下培養(yǎng)72 h，取5 mL除去菌體的培養(yǎng)液，以2.5 mol/L的NaOH溶液中和至pH值為7.0，加入5%FeCl3溶液5～6滴，形成紅褐色沉淀者為產(chǎn)醋酸細(xì)菌。

1.3.4醋酸產(chǎn)量的測定

制備含7%vol乙醇的產(chǎn)酸培養(yǎng)基于裝液量50 mL/250 mL的三角瓶中，在溫度30℃條件下，110 r/min搖床培養(yǎng)72 h，采用酸堿滴定法測定總酸（以醋酸計）。取2 mL發(fā)酵液，加入50 mL蒸餾水，3～5滴0.5%酚酞溶液，用標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH溶液滴定至淺粉色，由消耗的NaOH溶液的體積來計算樣品中的醋酸量。產(chǎn)酸量計算公式如下：

式中：V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH體積，mL；V0為以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NaOH體積，mL；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；M為醋酸的摩爾質(zhì)量，60 g/mol；V樣為樣品體積，L。

1.3.5乙醇脫氫酶（ADH）活性測定

（1）酶液制備

取相應(yīng)時間段的酶液8 mL，4℃、3 000 r/min離心20 min；用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（kalium phosphate buffer，KPB）洗滌2～3次，重新懸浮于該溶液中（0.1 g濕菌體/3 mL KPB）；懸浮液在冰浴下進(jìn)行超聲破碎，240 W，20 min，即可獲得粗酶液。

（2）ADH測定參照WOOD W A的方法［13］

取Mcllvans緩沖液（pH 4.0）0.5 mL，1.0 mol/L乙醇溶液0.1 mL，粗酶液0.1 mL，6%Triton X-100溶液0.1 mL，于10 mL比色管中，25℃保溫5 min；加入0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液0.2 mL，25℃保溫5 min；再次，加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5 mL，25℃放置20 min，終止反應(yīng)；加入3.5 mL蒸餾水混合后，用722型分光光度計測定波長660 nm處的光密度值。

酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘氧化1 μmol乙醇所消耗的酶量為一個活力單位（U/mL）。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外線誘變結(jié)果及致死率測定

2.1.1最適紫外誘變時間的確定

采用18 W紫外燈照射對培養(yǎng)72 h的原始菌株進(jìn)行誘變，照射距離為40 cm，采用10倍稀釋法，統(tǒng)計誘變處理后菌液稀釋度為10-5的數(shù)據(jù)，觀察不同紫外線誘變時間對細(xì)胞致死率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著時間的延長，菌株的細(xì)胞致死率逐漸升高，結(jié)果表明原始菌株對紫外照射敏感，并且紫外線誘變時間越長對細(xì)胞的殺傷力越大，實驗確定最佳紫外誘變時間為40 s，細(xì)胞致死率為79.72%。

圖1　不同紫外誘變時間對致死率的影響Fig.1 Effect of different UV mutation time on lethality

2.1.2最適紫外誘變距離的確定

采用18 W紫外燈對培養(yǎng)72 h的原始菌株進(jìn)行誘變，照射時間為40 s，采用10倍稀釋法，統(tǒng)計誘變處理后菌液稀釋度為10-5對細(xì)胞致死率的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，隨著紫外線垂直距離的增加，菌株的細(xì)胞致死率逐漸降低，由此說明紫外線誘變距離越小對細(xì)胞的殺傷力越大，實驗確定最佳紫外誘變距離為40 cm，細(xì)胞致死率為81.92%。

圖2　不同誘變距離對致死率的影響Fig.2 Effect of different mutation distance on lethality

2.1.3最適菌液稀釋度的確定

采用18 W紫外燈進(jìn)行誘變，照射時間為40 s，照射距離為40 cm，統(tǒng)計紫外線誘變不同菌體濃度對細(xì)胞致死率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著菌體濃度稀釋倍數(shù)的增加，細(xì)胞致死率逐漸增加，甚至全部殺死，說明紫外線誘變對菌體濃度越小，細(xì)胞的殺傷力越大，實驗確定最佳紫外誘變的菌體濃度稀釋到10-5，細(xì)胞致死率為80.00%。

圖3　不同菌液稀釋度對致死率的影響Fig.3 Effect of different cell concentrations on lethality

2.1.4紫外誘變最佳條件組合確定

采用18 W紫外燈進(jìn)行誘變，設(shè)置照射時間為40 s，照射距離為40 cm，菌液稀釋度10-5，三組重復(fù)，統(tǒng)計紫外線誘變組合的細(xì)胞致死率，基本穩(wěn)定在82.15%左右，說明此誘變組合條件具有較高的穩(wěn)定性，可以作為紫外線誘變的最優(yōu)條件組合。

2.1.5紫外誘變最佳條件組合的誘變效應(yīng)

采用18 W紫外燈進(jìn)行誘變，設(shè)置照射時間為40 s，照射距離為40 cm，菌濃稀釋度10-5，培養(yǎng)后的平板菌落周圍會出現(xiàn)透明圈，計算HC比值，挑選HC比值大的15株紫外誘變菌株（如表1所示），將其移接到試管斜面上培養(yǎng)用于復(fù)篩。從表1可以看出，和對照相比，UV-3、UV-6、UV-11三種突變菌株的HC比值較大，可初步確定為紫外誘變的較優(yōu)菌株。

表1 紫外誘變對HC比值的影響Table 1 Effect of UV mutation on HC ratio

2.1.6產(chǎn)酸定性實驗

將上述斜面保藏菌種分別進(jìn)行產(chǎn)酸定性實驗，操作步驟見1.3.3。通過實驗發(fā)現(xiàn)，和對照相比，15株紫外誘變菌株均產(chǎn)生紅褐色沉淀。定性實驗結(jié)果表明，15株紫外誘變菌株均為產(chǎn)醋酸細(xì)菌。

綜上所述，通過紫外誘變效應(yīng)和產(chǎn)酸定性實驗綜合比較，初步挑選UV-3、UV-6、UV-11三種正突變菌株進(jìn)行醋酸菌的定量實驗。

2.2定量檢測分析

2.2.1產(chǎn)酸量的測定

配制UV-3、UV-6、UV-11三種紫外誘變正突變菌株生長的產(chǎn)酸培養(yǎng)基，于裝液量50 mL/250 mL的三角瓶，30℃條件下、110 r/min，每隔24 h測定醋酸總量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，隨著紫外誘變后菌體培養(yǎng)時間的延長，和對照相比，醋酸菌產(chǎn)生的醋酸總量逐漸增加，UV-3、UV-6、UV-11三種誘變菌株的增加幅度有所不同，UV-3、UV-6、UV-11三株正突變菌株的產(chǎn)酸總量和對照相比分別提高了20.45%、23.73%、24.61%。結(jié)果表明，紫外誘變可以有效提高醋酸菌的產(chǎn)酸量，對微生物生產(chǎn)有一定的實踐意義。

圖4　三株正突變菌株產(chǎn)酸量變化Fig.4 Acid production changes of three positive mutant strains

2.2.2乙醇脫氫酶活性測定

ADH是醋酸菌培養(yǎng)過程中的重要代謝酶。配制UV-3、UV-6、UV-11三種誘變菌株生長的擴(kuò)大培養(yǎng)基，在裝液量50 mL/250 mL的三角瓶，30℃、110 r/min條件下，每隔24 h取樣，測定乙醇脫氫酶活性，結(jié)果如圖5所示。

圖5　三株正突變菌株ADH酶活變化Fig.5 ADH enzyme activity changes of three positive mutant strains

由圖5可知，通過紫外線誘變處理，ADH酶活性隨著菌液培養(yǎng)時間的延長均高于對照，且變化相似，均表現(xiàn)為先升高后降低再趨于平穩(wěn)，當(dāng)UV-3、UV-6、UV-11三種醋酸菌菌株培養(yǎng)48 h時ADH酶活均達(dá)到峰值，分別是原菌株的2.7、3.5、3.7倍，隨后酶活性均下降。實驗結(jié)果表明，紫外線照射處理能有效激活醋酸菌培養(yǎng)48 h前的ADH酶活性。

2.2.3乙醇脫氫酶活性和產(chǎn)酸量之間的關(guān)系

配制UV-3、UV-6、UV-11三種誘變菌株生長的擴(kuò)大培養(yǎng)基，同時檢測蘋果醋發(fā)酵過程中乙醇脫氫酶活力和產(chǎn)酸量的相互關(guān)系，結(jié)果如圖6所示。

圖6　三株正突變菌株在醋酸發(fā)酵過程中ADH酶活、產(chǎn)酸量變化曲線Fig.6 Variation curve of ADH enzyme activity and acetic acid production during acetic fermentation of three positive mutant strains

由圖6可以看出，當(dāng)菌液培養(yǎng)時間＜48 h時，ADH活力和產(chǎn)酸總量均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，表明ADH和產(chǎn)酸總量呈正相關(guān)；但是，當(dāng)菌液培養(yǎng)48 h后，ADH隨著培養(yǎng)時間的延長卻逐漸下降，而產(chǎn)酸總量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，表明ADH和產(chǎn)酸總量呈負(fù)相關(guān)。推測可能由于前期發(fā)酵過程中乙酸的不斷累積，導(dǎo)致ADH酶活受到酶作用產(chǎn)物的明顯抑制，而且隨著時間的推移，菌體生長也開始進(jìn)入衰亡期，因此從48 h開始ADH酶活逐漸降低；因為產(chǎn)酸是一個累積的過程，48 h后發(fā)酵過程中產(chǎn)酸速率不斷增大，醋酸含量也隨之逐漸增加，綜上表明ADH和產(chǎn)酸總量的變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)。這與陳偉等［14-15］研究的變化趨勢基本一致。當(dāng)然，其兩者相互作用的復(fù)雜生理生化過程，還有待進(jìn)一步深入研究。

3　結(jié)論

本實驗以醋酸菌20056為研究對象，采用紫外線誘變手段，確定最佳誘變條件為紫外誘變時間40 s、誘變距離40 cm、菌液稀釋度10-5，此時細(xì)胞致死率穩(wěn)定在82.15%左右。因此，初步篩選獲得了UV-3、UV-6、UV-11三種適合蘋果汁醋酸發(fā)酵的較優(yōu)菌株，提高了醋酸菌的產(chǎn)酸總量；可用檢測菌株ADH酶活和產(chǎn)酸總量變化的方法，作為篩選工業(yè)菌株和鑒別菌株性能優(yōu)劣的重要參考指標(biāo)，為優(yōu)勢醋酸菌的選育提供了簡便、有效的育種途徑。

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Mutation breeding of predominantAcetobacter pasteurianusin apple vinegar production

SONG Juan，HU Shenghai，LI Mingze，ZHANG Jihong
（Agricultural Product Storage and Processing Research Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）

Using cider wine fermentation mash containing 7%vol alcohol as domestication medium，the introduced strainAcetobacter pasteurianus 20056 was domesticated and the mutant strain was screened.By UV mutagenesis，results showed that the optimal mutagenesis condition was mutation time 40 s，mutation distance 40 cm and cell dulition 10-5.Under the conditions，the cell lethality reached 82.15%.Fifteen mutant strains were preliminarily screened，through UV mutation effect，acid production experiment，and qualitative experiment，three positive mutant strains UV-3，UV-6 and UV-11 were screened.Compared with the original strain，the acid production of the mutant strain improved 20.45%，23.73%，24.61%，respectively.The peak ADH enzyme activity was 2.7，3.5，3.7 times of the original strain.Results showed that UV mutation improved alcohol conversion ability of the cider wine fermentation mash effectively，and it provided a simple and efficient breeding method.

apple vinegar；acetic acid bacteria；domestication；mutation breeding

TS264.2

0254-5071（2016）07-0040-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.009

2016-01-29

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（31460449）；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項（GNSW-2013-31）

宋娟（1988-），女，研究實習(xí)員，碩士，研究方向為食品發(fā)酵。