元建國(guó)，葉海艷，李世林△，陳利民▲

(1.成都大學(xué)門診部，成都 610000;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所，成都 610063)

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甲氨蝶呤對(duì)固有免疫關(guān)鍵分子干擾素的影響研究

元建國(guó)1，葉海艷2，李世林2△，陳利民2▲

(1.成都大學(xué)門診部，成都 610000;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院輸血研究所，成都 610063)

目的為了探究具有免疫抑制和抗腫瘤作用的甲氨蝶呤(MTX)對(duì)干擾素(IFN)的影響，以及IFN在風(fēng)濕免疫性疾病中的作用。方法以5、20、100 μg/mL濃度梯度的MTX作用于Huh7.5.1細(xì)胞48 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量檢測(cè)MTX干預(yù)后Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干擾素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表達(dá)量。結(jié)果Huh7.5.1細(xì)胞在MTX(5、20 μg/mL)干預(yù)下內(nèi)源性IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且隨著MTX干預(yù)濃度的上升而上升；MTX 濃度為 100 μg/mL 時(shí)，與對(duì)照組相比雖有上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表達(dá)量?jī)H在MTX濃度為20 μg/mL時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在5、100 μg/mL 時(shí)雖有上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在MTX干預(yù)后，MxA和ISG15的mRNA表達(dá)量均有不同程度的上升(P<0.05)。結(jié)論小劑量MTX治療風(fēng)濕免疫性疾病取得良好的療效與IFN相關(guān)。

甲氨蝶呤；固有免疫；干擾素

固有免疫是機(jī)體與生俱來的抵御病原微生物入侵的第一道防線，具有抵抗體外病原體侵襲、清除體內(nèi)抗原性異物的能力，是生物體在漫長(zhǎng)的進(jìn)化和自然選擇過程中形成的防御機(jī)制[1]。固有免疫具有抗感染、抗腫瘤、維持自身耐受，以及啟動(dòng)和參與特異性免疫等作用[2]。干擾素(IFN)是固有免疫系統(tǒng)重要的固有免疫分子，是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因其具有干擾病毒的感染和復(fù)制功能而得名。根據(jù)其來源和理化性質(zhì)，可分為Ⅰ型(IFN-α、IFN-β)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型。

IFN-α、IFN-β由許多不同的細(xì)胞(所有有核細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)在應(yīng)答病毒或胞內(nèi)細(xì)菌感染時(shí)產(chǎn)生。IFN-α、IFN-β 的受體相同，幾乎表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面，功能廣泛，包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)，以及促進(jìn)組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子和Ⅱ類分子的表達(dá)。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抗病毒，活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)MHC分子表達(dá)的抗原提呈，誘導(dǎo)Th1分化，抑制Th2分化的作用[3-4]。

甲氨蝶呤(MTX)用于風(fēng)濕免疫性疾病已數(shù)十年，被全世界的風(fēng)濕免疫學(xué)者普遍接受，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎、干燥綜合征等疾病中都取得了良好的效果[5]。MTX是二氫葉酸還原酶抑制劑，是一種葉酸拮抗劑，與二氫葉酸還原酶底物葉酸結(jié)構(gòu)相似，能有效地占據(jù)酶催化中心，它與該酶的結(jié)合力比葉酸大106倍，對(duì)二氫葉酸還原酶呈強(qiáng)大而持久的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使二氫葉酸不能變成四氫葉酸，導(dǎo)致DNA合成障礙，阻止嘌呤核苷酸的合成，而干擾蛋白質(zhì)的合成[6-8]。

IFN是固有免疫分子中的一種細(xì)胞因子，是固有免疫系統(tǒng)重要的組成成分，在整個(gè)免疫系統(tǒng)中具有重要意義，但在風(fēng)濕免疫性疾病中，IFN在疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸、預(yù)后中的作用和地位尚不十分清楚，同時(shí)，臨床常用的免疫抑制劑對(duì)IFN的影響亦不明了。因此，為了探究MTX對(duì)IFN的影響，以及IFN在風(fēng)濕免疫性疾病中的作用，本研究以不同濃度的MTX作用于Huh7.5.1細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量檢測(cè)MTX干預(yù)后Huh7.5.1細(xì)胞內(nèi)IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干擾素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表達(dá)量，探討并試圖從基因水平證明MTX對(duì)IFN的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞Huh7.5.1細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。

1.1.2主要試劑及儀器MTX片；胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Hycone公司；達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM，高糖)購(gòu)自Hyclone公司；非必需氨基酸(Non-essentialamino acids，NEAA)購(gòu)自Gibico公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)購(gòu)自Hyclone公司；0.25%的胰酶購(gòu)自Gibico公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自Gibico公司；IFN-α購(gòu)自Merck&Co公司；Trizol購(gòu)自Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Bio-rad公司；SYBR熒光染料試劑盒購(gòu)自Roche公司。

倒置熒光顯微鏡(CKX31型)購(gòu)自O(shè)lympus公司；Fast Real-Time PCR system(7500HT)購(gòu)自Applied Biosystem公司；PCR儀(Veriti 96 Well)購(gòu)自Applied Biosystem公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo electric公司；生物潔凈工作臺(tái)購(gòu)自Airtech公司；96孔板離心機(jī)(3K15)購(gòu)自Sigma公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1MTX片溶解液的配置配置0.71%的無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液和0.69%磷酸二氫鈉(NaH2PO4)溶液，取500 mL Na2HPO4溶液和600 mL NaH2PO4溶液混合搖勻，用2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值為6.9。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及RNA的提取(1)細(xì)胞培養(yǎng):①用0.25%的胰酶將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化下來后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；②取10 μL細(xì)胞懸液至10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)中充分混勻后加入計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)；③根據(jù)細(xì)胞密度加入完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL；④在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入500 μL Huh7.5.1細(xì)胞懸液；⑤37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。(2)分組：細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物處理，將MTX加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，使終濃度分別為5、20、100 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，未做任何處理。(3)RNA提取:將Trizol加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL，反復(fù)吹打細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫放置5 min。加入40 μL氯仿，劇烈振蕩10 s后室溫放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。吸取100 μL水相轉(zhuǎn)移入新的 1.5 mL離心管中，加入100 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，移去上清。加入 200 μL 75%乙醇，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清以洗滌沉淀。室溫放置使乙醇揮發(fā)后，加入 30 μL無RNA酶(RNase)的焦碳酸二乙酯(DEPC)水，用槍頭吸打幾次使其充分溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物的序列和合成[9-11]IFN-α：上游引物5′-TCG CCC TTT GCT TTA CTG AT-3′，下游引物5′-GGG TCT CAG GGA GAT CAC AG-3′；IFN-β：上游引物5′-AAA CTC ATA GCA GTC TGC A-3′，下游引物5′-AGG AGA TCT TCA GTT TCG GAG G-3′；IFN-γ：上游引物5′-CCA ACG CAA AGC AAT ACA TGA-3′，下游引物5′-TTT TCG CTT CCC TGT TTT AGC-3′；MxA：上游引物5′-GTG CAT TGC AGA AGG TCA GA-3′，下游引物5′-CTG GTG ATA GGC CAT CAG GT-3′；ISG15：上游引物5′-CGC AGA TCA CCC AGA AGA TT-3′，下游引物5′-GCC CTT GTT ATT CCT CAC CA-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游引物5′-GCC TCC TGC ACC ACC AAC TG-3′，下游引物5′-ACG CCT GCT TCA CCA CCT TC-3′。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系如下:5×Mix 1 μL，RNA模板3 μL，ddH2O 6 μL，總體積10 μL。反應(yīng)條件:30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Roche公司的SYBR熒光染料試劑盒，反應(yīng)體積為20 μL,反應(yīng)體系:2×SYBR mix 10 μL，Primer-R 1μL，Primer-F 1μL，Template 1μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法，以看家基因GAPDH作內(nèi)參，得出待測(cè)目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用ANOVA軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1各組細(xì)胞內(nèi)IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA的表達(dá)比較Huh7.5.1細(xì)胞在MTX(5、20 μg/mL)干預(yù)下內(nèi)源性IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均上升,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著MTX干預(yù)濃度的上升而上升；MTX 濃度為 100 μg/mL 時(shí)，與對(duì)照組相比雖有上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表達(dá)量?jī)H在MTX濃度為20 μg/mL時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在5、100 μg/mL 時(shí)雖有上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖1不同濃度的MTX對(duì)Huh7.5.1細(xì)胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA表達(dá)量的影響

2.2各組ISG15、MxA mRNA的表達(dá)比較在MTX干預(yù)后，MxA和ISG15的mRNA表達(dá)量均有不同程度的上升，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖2MTX對(duì)ISG15、MxA mRNA表達(dá)量的影響

3　討　　論

在臨床實(shí)踐中，大劑量MTX被用于抗腫瘤治療，主要是抑制細(xì)胞增殖和復(fù)制，即抗增殖作用，是通過抑制二氫葉酸還原酶而阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，可阻止DNA合成，也可干擾RNA蛋白質(zhì)的生物合成，從而達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞生成的作用[12]。而治療風(fēng)濕免疫性疾病是小劑量應(yīng)用，其作用機(jī)制不能完全用抗增殖進(jìn)行解釋，每周1次小劑量治療風(fēng)濕病的機(jī)制可能是幾種作用的結(jié)合，包括抗葉酸、免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制及抗炎作用[13]。

IFN屬于細(xì)胞因子中的一類，主要有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。本研究只涉及了Ⅰ型和Ⅱ型。IFN-α、IFN-β可由體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-γ由自然殺傷細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的功能[14]。在正常生理情況下，多數(shù)細(xì)胞可以自發(fā)分泌少量?jī)?nèi)源性Ⅰ型IFN。IFN與干擾素受體(IFNR)結(jié)合激活Janus酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase signal transducersand activators of transcription，JAK/STAT)信號(hào)通路，該通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡，以及在免疫調(diào)節(jié)、炎癥和腫瘤等多種病理生理過程中能發(fā)揮重要的作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)表明，MTX能明顯促進(jìn)內(nèi)源性IFN的分泌，并且能與IFNR結(jié)合激活I(lǐng)FN信號(hào)通路從而促進(jìn)ISGs的表達(dá)，提示小劑量MTX治療風(fēng)濕免疫性疾病取得的良好療效與IFN相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為進(jìn)一步研究MTX治療疾病的機(jī)制，以及對(duì)MTX的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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The effects of methotrexate on innate immune molecule interferon

Yuan Jianguo1，Ye Haiyan2，Li Shilin2△，Chen Limin2▲

(1.Department of Outpatient,Chengdu University,Chengdu,Sichuan 610000,China；2.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College,Chengdu,Sichuan 610063,China)

ObjectiveTo explore the effect of methotrexate(MTX),which has immunosuppressive and antitumor properties on interferon production and the role of interferon(IFN) in rheumatic autoimmune disease.MethodsCutured Huh7.5.1 cells were treated with different concentration of MTX(5,20,100 μg/mL) for 48 hours.After MTX intervention,the mRNA expression levels of IFN-α,IFN-β,IFN-γ,ISG15,MxA in Huh7.5.1 cells were quantified by real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsCompared with the control group,the endogenous IFN-α,IFN-β mRNA expressions of Huh7.5.1 cells under the intervention of methotrexate(5, 20 μg/mL) were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05),which was increaing with the rise of the concentration of MTX intervention.MTX concentration of 100 μg/mL, compared with the control group,although there was an increase,but without statistical significance(P>0.05).While the mRNA expression of IFN-α was only significantly different when the MTX concentration was 20 μg/mL(P<0.05).Although there was an increase in 5 μg/mL and 100 μg/mL, there was no statistical significance(P>0.05).In MTX, the expression levels of MxA and ISG15 were increased in different degrees(P<0.05).ConclusionThe good efficacy of low-dose MTX in the treatment of rheumatic autoimmune diseases may be related to IFN.

methotrexate;innate immune;interferon

元建國(guó)(1955-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事風(fēng)濕免疫研究?！?/p>

，E-mail:shilin-li@hotmail.com?！ㄓ嵶髡?，E-mail:limin_chen_99@yahoo.com。

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.001

R392.1

A

1671-8348(2016)22-3025-03

2016-02-12

2016-03-25)