陳　亮，黃曉峰，郭　平，吳非非

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院口腔科，安徽蕪湖 241001;2.南京大學口腔醫(yī)學院/南京市口腔醫(yī)院病理科，江蘇南京210008)

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口腔白斑和鱗狀細胞癌中人乳頭瘤病毒感染分析

陳亮1，黃曉峰2，郭平1，吳非非1

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院口腔科，安徽蕪湖 241001;2.南京大學口腔醫(yī)學院/南京市口腔醫(yī)院病理科，江蘇南京210008)

目的探討人乳頭瘤病毒(HPV)16/18感染與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)臨床病理特征間的關系。方法原位雜交(ISH)和免疫組織化學(IHC)分別檢測10例正?？谇火つ?，26例口腔白斑(OLK)和56例OSCC中的HPV16/18水平，分析不同組間HPV16/18陽性率間的差異和OSCC中HPV16/18感染與性別、年齡、TNM分期、組織學分化、淋巴結轉移、吸煙的關系。結果ISH和IHC檢測HPV16/18陽性率差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)；OSCC和OLK患者中HPV16/18陽性率高于正常口腔黏膜(P<0.05)；OSCC中吸煙者HPV16/18陽性率明顯高于非吸煙者(P<0.05)。結論HPV16/18感染是部分OSCC的發(fā)病因素,其與吸煙對OSCC發(fā)病具有協(xié)同作用。

腫瘤，鱗狀細胞；白斑，口腔；口腔腫瘤；原位雜交；人乳頭瘤病毒

口腔白斑(oral leukoplakia,OLK)是目前公認的口腔黏膜癌前病變，口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是具有不同程度鱗狀分化的侵襲性、上皮性的惡性腫瘤，在口腔頜面部惡性腫瘤中居于首位。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一種特異感染人類上皮黏膜的環(huán)狀DNA病毒，目前研究發(fā)現(xiàn)其感染也是部分口腔癌的致病因素，其中HPV16/18是具有高度致癌潛能的基因型。因此，本研究采用兩種檢測方法探討OLK、OSCC中HPV16/18表達與臨床病理特征間的關系，為進一步研究提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集南京大學醫(yī)學院附屬南京市口腔醫(yī)院病理科56例患者的病理確診且臨床病理資料完整的OSCC標本，其中男29例，女27例；年齡30～82歲，平均58歲，0～<58歲24例，≥58歲32例； TNM分期(2002年UICC標準)：Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ期8例，Ⅳ期21例；分化程度：高分化21例，中分化26例，低分化9例；有淋巴結轉移22例，無淋巴結轉移34例；非吸煙者36例，吸煙者20例。同時，收集同科室26份OLK標本，10份黏液囊腫邊緣黏膜組織(檢測為正?？谇火つ?。

1.2方法

1.2.1試驗材料用于原位雜交(ISH)的HPV16/18 特異性探針和免疫組織化學(IHC)HPV16/18兔抗人單克隆抗體即用型工作液均購于福州泰普生物科學有限公司。通用型EnVision IHC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、抗原修復液乙二胺四乙酸(EDTA)均為丹麥Dako公司產(chǎn)品。

1.2.2主要操作步驟10例正?？谇火つ?，26例OLK，56例OSCC標本均經(jīng)10%甲醛固定，然后常規(guī)脫水，石蠟包埋和4 μm連續(xù)切片，最后經(jīng)脫蠟及水化。IHC EnVision法主要步驟：標本切片經(jīng)高溫和高壓抗原修復，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min，最后經(jīng)DAB法顯色。ISH法主要操作步驟：標本切片微波雜交預處理，特異性探針雜交，信號放大，最后經(jīng)組織細胞原位DAB法顯色。

1.2.3結果判斷探針和一抗采用PBS代替做出的試驗結果作為HPV16/18陰性對照，已知HPV16/18陽性的尖銳濕疣作為陽性對照。IHC法檢測：標本細胞核呈棕黃色團塊樣或彌漫性顆粒為HPV抗原(+)，反之為HPV抗原(-)。ISH法檢測時標本細胞核呈棕褐色團塊樣或彌漫顆粒著色為HPV-DNA(+)，反之為HPV-DNA(-)。

1.3統(tǒng)計學處理試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　　果

2.1IHC、ISH法檢測各組標本中HPV16/18的陽性率IHC法陽性細胞核呈棕黃色團塊樣或彌漫性顆粒著色(圖1、2)，而ISH法陽性細胞核呈清晰的棕褐色團塊樣或彌漫顆粒著色(圖3、4)。兩種檢測方法相比，ISH法檢測結果鏡下觀察背景清晰，對比度強，陽性細胞并非都是挖空細胞。IHC、ISH兩種檢測方法檢測所選標本HPV16/18陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HPV16/18感染率在OLK和OSCC間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在OLK和OSCC中顯著高于正?？谇火つ?P<0.05)，見表1、圖5。

表1　正?？谇火つぁLK、OSCC中HPV16/18的陽性表達(n)

圖1　OLK中HPV16/18抗原(+)表達(IHC，×400)

圖2　OSCC中HPV16/18抗原(+)表達(IHC，×400)

2.2HPV16/18陽性率與OSCC患者臨床病理特征間的相關性HPV16/18陽性率與患者的性別、年齡、臨床TNM分期、組織學分化程度及淋巴結是否轉移均無關(P>0.05)，而在吸煙患者標本中HPV16/18陽性率顯著高于非吸煙患者(P<0.05)，見表2。

圖3　OLK中HPV16/18-DNA(+)表達(ISH，×400)

圖4　OSCC中HPV16/18-DNA(+)表達(ISH，×400)

圖5　ISH、免疫組織化學檢測HPV16/18的陽性率

表2　HPV16/18陽性數(shù)與口腔鱗癌臨床病理特征間的相關性

續(xù)表2　HPV16/18陽性數(shù)與口腔鱗癌臨床病理特征間的相關性

3　討　　論

OSCC呈侵襲性生長，是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占90%，全球每年新增口腔癌病例近3萬例[1]，主要致病因素包括煙酒、咀嚼檳榔、殘根殘冠及化學和生物刺激等。癌前病變中的OLK是以上皮異常增生為主要病理改變的一種黏膜病，癌變率為3%～5%。高危型HPV16/18可引起上皮的惡性腫瘤，最常見的是子宮頸癌，此外還是部分口腔癌[2-3]和口咽癌的主要致病因素[4-5]。

目前雖然有多種檢測HPV感染的方法，但因材料、試驗條件、判讀標準等差異，同一組標本HPV陽性率存在差異。IHC利用抗體檢測標本中HPV-Ag的水平，優(yōu)點是操作簡單、能定位，缺點是抗體針對衣殼蛋白常在復制晚期出現(xiàn)，會導致檢測的低敏性和假陰性；ISH利用特異性探針與標本的HPV-DNA進行雜交，具有高靈敏和特異性，是比較理想的檢測法，但常受到標本中HPV-DNA數(shù)量的影響[6-7]。本研究采用上述兩種檢測法分別對所選標本行HPV16/18檢測，結果顯示二者檢測出的HPV16/18陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但ISH法檢測HPV16/18陽性的標本顯微鏡下較清晰。

研究HPV16/18感染與口腔鱗癌、癌前病變及正常黏膜的相關性，回顧文獻可發(fā)現(xiàn)HPV16/18感染與口腔黏膜癌、OLK密切相關。Miller等[8]采用了Meta分析對1982～1997年間發(fā)表于Medline上有關HPV與口腔癌關系的文章進行了研究，結果顯示口腔癌感染HPV的合并優(yōu)勢比是正常黏膜的5.37倍。Mattila等[9]在15.9%的OLK中檢測到HPV，而Syrj?nen等[10]在29%的OLK中檢測出HPV。本研究OSCC和OLK中HPV16/18陽性率明顯高于正常黏膜，結果與之前研究相一致[8-10]，提示HPV16/18感染可能是OSCC或是癌前病變的致病因素之一。但HPV感染和口腔黏膜癌變間的因果關系目前仍無法解釋，其具體機制有待研究。

長久以來，煙酒被認為是OSCC的首要危險因素，但有近10%～20%的病例無煙酒史，這類腫瘤發(fā)病機制可能與病毒感染有關[11]。本研究分析HPV感染與OSCC臨床資料(包含年齡、性別、腫瘤臨床分期、組織分化程度、淋巴結是否遠處轉移及吸煙史)間的相關性，結果顯示HPV感染僅與患者是否吸煙有關，提示吸煙與HPV感染對口腔癌的發(fā)生具有協(xié)同作用，與Schwartz等[12]研究相一致，但也有研究未發(fā)現(xiàn)二者有協(xié)同作用[13-14]。因此，二者在OSCC中的具體關系還有待進一步研究。

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Human papillomavirus infection in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma

Chen Liang1,Huang Xiaofeng2,Guo Ping1,Wu Feifei1

(1.Department of Stomatology,Yijishan Hospital,the First of Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu,Anhui 241001,China;2.Department of Pathology,School of Stomatology,Nanjing University/ Nanjing Stomatological Hospital,Nanjing,Jiangsu 210008,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between HPV16/18 infection and the clinicopathological characteristics of oral squamous cell carcinoma (OSCC).MethodsHPV16/18 was detected by the situ hybridization (ISH) and immunohistochemical (IHC) in 10 cases of normal oral mucosa,26 cases of oral leukoplakia (OLK) and 56 cases of oral squamous cell carcinoma (OSCC).We analysed the difference of the HPV16/18 positive rate among groups,and explored the correlation between HPV infection and the gender,age,TNM staging,histological garde,lymph node metastasis and smoking in OSCC patients.ResultsThere was no significant difference between ISH and IHC in detecting HPV16/18 positive rate (P>0.05).The HPV16/18 positive rates in patients of OLK and OSCC were significantly higher than that in normal oral mucosa patients(P<0.05).The HPV16/18 positive rate in smokers was significantly higher than that in non-smokers of OSCC(P<0.05).ConclusionHPV16/18 infection is considered to be a pathogenic factor in OSCC.HPV16/18 infection and smoking have a synergistic effect on the pathogenesis of OSCC.

neoplasms,squamous cell；leukoplakia,oral；mouth neoplasms；in situ hybridization；human papillomavirus

陳亮(1983-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事口腔頜面部腫瘤方面研究。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.022

R780.2

A

1671-8348(2016)22-3086-03

2016-02-08

2016-05-11)