王程強(qiáng)，歐超燕，施文祥，錢　波

(桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541004)

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茶多酚對(duì)鋁致大鼠睪丸支持細(xì)胞損傷的拮抗作用研究*

王程強(qiáng)，歐超燕，施文祥，錢波△

(桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西桂林 541004)

目的探討茶多酚(TP)對(duì)鋁暴露大鼠睪丸支持細(xì)胞損傷的拮抗作用。方法原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞。將細(xì)胞分為0 μmol/L AlCl3(對(duì)照組)、400 μmol/L AlCl3(鋁暴露組)、40 μg/mL TP +400 μmol/L AlCl3組(低劑量拮抗組)、160 μg/mL茶多酚+400 μmol/L AlCl3組(高劑量拮抗組)，各組用相應(yīng)的藥物處理24 h。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)活性；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)抑制素B(INHB)mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，鋁暴露組的細(xì)胞活性、INHB mRNA表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鋁暴露組比較，低劑量拮抗組、高劑量拮抗組能夠明顯提高細(xì)胞活性，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鋁暴露組比較，高劑量拮抗組能夠明顯提高INHB mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論高劑量TP能夠拮抗鋁對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞的損傷。

茶多酚；三氯化鋁；睪丸支持細(xì)胞；抑制素B

鋁在環(huán)境中和人類的生活中廣泛存在，且能夠在人體里逐漸蓄積，其毒性主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。除了神經(jīng)毒性外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)鋁對(duì)生殖系統(tǒng)也有毒性。無(wú)論是流行病學(xué)研究還是整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，都證實(shí)了鋁會(huì)對(duì)雄性的生殖系統(tǒng)帶來(lái)?yè)p傷。有研究顯示，鋁暴露將導(dǎo)致雄性小鼠的睪丸、附睪質(zhì)量減輕，導(dǎo)致精子數(shù)量和質(zhì)量顯著下降[1]，但是作用機(jī)制目前仍不清楚。睪丸支持細(xì)胞是睪丸組織中重要的保姆細(xì)胞，它能夠?yàn)榫犹峁┓€(wěn)定的微環(huán)境，為生精提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量，還能分泌大量的生長(zhǎng)因子參與生精細(xì)胞的分化和成熟，其功能的受損將對(duì)精子的生成產(chǎn)生巨大的影響。因此，睪丸支持細(xì)胞被認(rèn)為是評(píng)價(jià)雄性生殖毒性的重要靶細(xì)胞[2]。支持細(xì)胞所分泌的抑制素B(INHB)能直接反映其功能狀態(tài)，一旦生精受到抑制，INHB的水平將發(fā)生變化[3-4]。目前排鋁藥物主要是鋁螯合劑，但其不良反應(yīng)多。近年來(lái)，患者對(duì)于不良反應(yīng)小的天然藥物的需求越來(lái)越高，開發(fā)出一種不良反應(yīng)比較小的驅(qū)鋁藥物迫在眉睫[5]。茶多酚(TP)是一種天然的強(qiáng)抗氧化劑，可以預(yù)防腫瘤及神經(jīng)退行性疾病[6-7]。但其能否保護(hù)鋁暴露的睪丸支持細(xì)胞，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究將探討TP對(duì)鋁暴露大鼠睪丸支持細(xì)胞的保護(hù)作用，并初步研究其可能的發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠6只，18～22 d，以體質(zhì)量50～55 g睪丸未降出腹腔為標(biāo)準(zhǔn)。由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要儀器與試劑TP(浙江東方茶葉科技有限公司，≥95%)，氯化鋁(分析純，廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品)，DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)，胎牛血清(武漢谷歌生物有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)，膠原酶Ⅰ(美國(guó)Sigma公司)，胰蛋白酶(Difco公司)，第一鏈cDNA試劑盒和PCR試劑盒(北京賽百盛公司)，酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)[8]頸椎脫臼法處死大鼠。鼠體置于75%乙醇中浸泡2 min,然后利用眼科剪在超凈工作臺(tái)中取出大鼠睪丸，放入含有預(yù)冷的D-Hanks液的培養(yǎng)皿中。剝除睪丸被膜，用眼科剪把睪丸實(shí)質(zhì)剪碎成約1 mm3的碎塊。加入D-Hanks液，靜置5 min后，沖洗2次。采取胰蛋白酶和膠原酶二步法消化組織。將睪丸組織碎塊加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴振蕩消化30 min。加入少量胎牛血清終止消化，800 r/min離心5 min去上清。加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min去上清，再用D-Hanks液洗滌沉淀。再加2 mL 0.1%膠原酶Ⅰ液，37 ℃水浴振蕩消化20 min。取出后放入超凈臺(tái)，將消化液經(jīng)100目不銹鋼篩過(guò)濾。加入少量含胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。用0.4%臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞含量，補(bǔ)充適量含血清培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至合適。接種細(xì)胞在培養(yǎng)箱中，37 ℃ 5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。48 h后棄培養(yǎng)液，用D-Hanks液沖洗，再用pH7.4的20 mmol/L Tris-HCl低滲處理3 min，以去除精原細(xì)胞。

1.2.2大鼠睪丸支持細(xì)胞的鑒定采取Feulgen染色法對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行鑒定[9]。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及處理本實(shí)驗(yàn)采用離體培養(yǎng)2 d后的原代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)處理，將細(xì)胞分為0 μmol/L AlCl3(對(duì)照組)、400 μmol/L AlCl3(鋁暴露組)、 40 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3組(低劑量拮抗組)、160 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3組(高劑量拮抗組)，各組用相應(yīng)的藥物處理24 h。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性調(diào)整細(xì)胞密度5×105/mL接種在96孔板中,每孔200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，施加相關(guān)處理因素。各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)相關(guān)處理24 h后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫下振蕩10 min,使結(jié)晶物體完全溶解。利用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5采取RT-PCR法檢測(cè)大鼠睪丸支持細(xì)胞中INHB mRNA表達(dá)水平將培養(yǎng)于96孔板的各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)24 h處理后，加入Trizol提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，具體步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。INHB：上游引物5′-CTC TGC TGC TGC TCC TTT TG-3′,下游引物5′-TGG TGG CTG CGT ATG TG-3′，產(chǎn)物片段361 bp。內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游引物5′-GGT GCT GAG TAT GTC GTG GAG T-3′,下游引物5′-CAG TCT TCT GAG TGG CAG TGA T-3′，產(chǎn)物片段292 bp。引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。以2 μL cDNA為模板，建立PCR反應(yīng)體系[包括10×PCR緩沖液5 μL,MgCl27 μL,三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)2 μL,上下游引物各1 μL，2 μL cDNA，Taq酶1 μL，滅菌雙蒸水31 μL]。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min;60 ℃ 10 min循環(huán)35次。5 μL用瓊脂糖凝膠電泳分離，采取Gene Tools分析條帶A值，以INHB與GAPDH的比值代表其mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)運(yùn)用于各組之間的兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1茶多酚對(duì)鋁暴露支持細(xì)胞活性的影響支持細(xì)胞活性鋁暴露組(0.822±0.028)、低劑量拮抗組(0.933±0.033)、高劑量拮抗組(0.950±0.026)與對(duì)照組(1.008±0.044)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量拮抗組、高劑量拮抗組與鋁暴露組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2TP對(duì)鋁暴露大鼠睪丸支持細(xì)胞INHB mRNA表達(dá)的影響INHB mRNA鋁暴露組(0.333±0.022)、低劑量拮抗組(0.365±0.010)、高劑量拮抗組(0.412±0.019)與對(duì)照組(0.452±0.011)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量拮抗組與鋁暴露組INHB mRNA表達(dá)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

M：DNA標(biāo)記物;1～4:鋁暴露組、對(duì)照組、高劑量拮抗組、低劑量拮抗組。

圖1INHB mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3　討　　論

睪丸是鋁雄性生殖毒性最敏感的器官之一。生精功能的障礙和睪酮合成的抑制是鋁雄性生殖毒性的主要表現(xiàn)形式。有研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠腹腔注射三氯化鋁，隨著劑量的增加，生精細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞都明顯減少[10]。鋁暴露會(huì)導(dǎo)致睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力下降，增加丙二醛(MDA)的含量[11]。鋁暴露將產(chǎn)生大量的活性氧化簇，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，導(dǎo)致精母細(xì)胞和精子壞死。正常精子的生成，都需要睪丸支持細(xì)胞。睪丸支持細(xì)胞具有保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)和支持生精細(xì)胞的功能。有研究證實(shí)，卵泡刺激素(FSH)能夠選擇性刺激支持細(xì)胞分泌INHB。FSH對(duì)雌性的生殖影響是巨大的、絕對(duì)的[12]，然而對(duì)雄性來(lái)說(shuō)，F(xiàn)SH的影響是比較細(xì)微的。如果通過(guò)基因敲除法敲除FSH基因，雌性動(dòng)物不育，而雄性小鼠卻依然可以生育。此外，INHB和精子濃度有很好的正相關(guān)性。鋁導(dǎo)致睪丸氧化損傷依然是最主要的機(jī)制。有研究表示鋁暴露后，將產(chǎn)生大量的一氧化氮合酶，從而抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，使睪酮的分泌將減少，導(dǎo)致精子濃度下降。隨著cAMP活性的下降，睪丸間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇進(jìn)入線粒體的量也隨之減少[13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，鋁暴露組的細(xì)胞活性、INHB mRNA表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。INHB對(duì)FSH的負(fù)反饋?zhàn)饔靡獜?qiáng)于正反饋。說(shuō)明支持細(xì)胞在受到鋁暴露后，將負(fù)反饋降低抑制素的表達(dá)，減少對(duì)FSH的抑制，促進(jìn)FSH分泌雄激素結(jié)合蛋白(ABP)。ABP能與睪酮結(jié)合，從而拮抗鋁對(duì)支持細(xì)胞的損傷效應(yīng)。

TP是一類富含酚羥基的化合物，提供活性氫，使自由基滅活，清除自由基過(guò)多引起的DNA損傷[14]。TP還能抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶mRNA的表達(dá)，從而阻斷一氧化氮的合成[15]。而抑制素的轉(zhuǎn)錄主要是受到FSH刺激的cAMP的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，TP能夠通過(guò)增加抑制素的轉(zhuǎn)錄，拮抗鋁對(duì)睪丸支持細(xì)胞的損傷效應(yīng)，增加睪丸支持細(xì)胞活性。其機(jī)制可能是提高cAMP活性，抑制一氧化氮合酶的產(chǎn)生，從而拮抗鋁對(duì)睪丸支持細(xì)胞的損傷。

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The antagonistic effects of tea polyphenols on damage of rat sertoli cells induced by Aluminum chloride*

Wang Chengqiang,Ou Chaoyan,Shi Wenxiang,Qian Bo△

(School of Public Health，Guilin Medical College,Guilin，Guangxi 541004，China)

ObjectiveTo observe the antagonistic effects of tea polyphenols on the damage of sertoli cells of rats induced by Aluminum chloride.MethodsRat sertoli cells were cultured,purified and identified.Cells were divided into 0 μmol/L AlCl3(control group),400 μmol/L AlCl3(Aluminum exposure group) and 40 μg/mL TP+400 μmol/L AlCl3group (low dose anti group) and 160 μg/mL tea polyphenol + 400 μmol/L AlCl3group (high dose of anti group),each group with the corresponding drug treatment for 24 h.MTT method was used to detect the growth activity of the cells in each group,the levels of INHB mRNA expression were measured by RT-PCR.ResultsCompared with the control groups,the cell viability and the level of INHB mRNA expression of Aluminum exposure groups were obviously decreased,there were statistical significant differences(P<0.05).Compared with the Aluminum exposure group,the cell viability of low dose anti group and high dose of anti group was remarkably increased,there were statistical significant differences(P<0.05).Compared with the Aluminum exposure group,the level of INHB mRNA expression of high dose of anti group was remarkably increased,there was statistial significant difference(P<0.05).ConclusionHigh dose of tea polyphenols can enhance the expression of mRNA,increase the cell activity,and antagonism Aluminum on the injury of rat′s testis.

tea polyphenols;Aluminum chloride;sertoli cell;inhibin-B

廣西科技廳自然基金青年基金一般項(xiàng)目(2012GXNSFBA053120)；廣西教育廳高等學(xué)校一般資助項(xiàng)目(201203YB121)。作者簡(jiǎn)介：王程強(qiáng)(1981-)，講師，碩士，主要從事毒理學(xué)的相關(guān)研究。△

，E-mail:805558188@qq.com。

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.003

R697

A

1671-8348(2016)22-3031-03

2016-02-15

2016-04-20)