唐　艷，謝　芳，楊承劍，農(nóng)皓如，馮　玲，曾慶坤（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

水牛乳中高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與鑒定

唐艷，謝芳*，楊承劍，農(nóng)皓如，馮玲，曾慶坤
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001）

從生水牛乳中篩選出兩株高產(chǎn)胞外多糖（EPS）的乳酸菌株LB2、LB7，經(jīng)MRS肉湯培養(yǎng)基發(fā)酵后，菌液中的胞外多糖（EPS）產(chǎn)量分別達(dá)135 mg/L、148 mg/L，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、16S rRNA序列分析，鑒定出菌株LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。將其應(yīng)用到水牛乳酸奶的發(fā)酵中，結(jié)果表明，植物乳桿菌LB2和類腸膜魏斯氏菌LB7均可用來發(fā)酵水牛乳酸奶，且能有效增加酸奶的黏度和胞外多糖產(chǎn)量，其黏度和EPS產(chǎn)量分別為4 050 mPa·s和149 mg/L。

乳酸菌；胞外多糖；篩選；菌種鑒定

乳酸菌胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中形成的位于細(xì)胞壁外的黏液多糖或莢膜多糖，屬于微生物胞外多糖的一種［1］。酸奶是以鮮奶或乳制品為原料，經(jīng)均質(zhì)（或不均質(zhì)）、殺菌、冷卻后加入特定微生物發(fā)酵劑、保溫發(fā)酵而制成的產(chǎn)品。酸乳在生產(chǎn)過程中乳酸菌會(huì)產(chǎn)生一種多糖類物質(zhì)，即乳酸菌胞外多糖［2］。乳酸菌胞外多糖可賦予酸乳特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，如增加酸乳的黏性和流變性、提高酸乳的持水性防止乳清析出、增強(qiáng)凝乳強(qiáng)度、增加酸乳的口感等［3］。因乳酸菌是食品級(jí)微生物生產(chǎn)菌，相較其他菌安全性高，所以近年來乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多，各國科學(xué)家試圖用基因工程的手段構(gòu)建高產(chǎn)胞外多糖菌株，但至今仍未成功。目前用于發(fā)酵酸乳的菌株產(chǎn)胞外多糖量很低，遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)所需［4］。因此高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選、工藝的優(yōu)化等仍是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。水牛乳作為我國南方地區(qū)特有的乳制品，其營養(yǎng)價(jià)值頗高，本試驗(yàn)從生鮮水牛乳中篩選出10株乳酸菌，對(duì)其進(jìn)一步分離純化，從中篩選出2株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了種屬分類鑒定，旨為將此類高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌應(yīng)用到水牛乳酸奶發(fā)酵中，并研制出富含EPS的水牛乳酸奶，為今后水牛乳高附加值功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮水牛奶：取自水牛研究所種牛場；API50CH、API50 CHL試劑：法國梅里埃公司。

乳酸菌分離培養(yǎng)基：含20 g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基；菌種活化培養(yǎng)基為體積分?jǐn)?shù)10%的脫脂水牛乳；MRS培養(yǎng)基：北京陸橋公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東凱環(huán)生物科技公司。

葡萄糖、蔗糖：蘇州正洋化工科技有限公司；30%過氧化氫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；G1060革蘭氏染色試劑盒：北京索寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SPX-150生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器材有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；JD500-2型電子天平：梅特勒-托多利儀器有限公司；LNG-T88臺(tái)式快速冷凍離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司；722可見光分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器廠；尼康ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器：北京國華科技集團(tuán)有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀（食品物性分析儀）：美國FTC公司；HI8424便攜式pH檢測儀：意大利HANNA（哈納）公司；乳脂分離機(jī)：北京夏音嘉塑科技有限公司；BCD-246WTM冰箱：美的集團(tuán)。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分離純化

無菌條件下，將新鮮水牛乳進(jìn)行梯度稀釋后涂布于含20 g/L CaCO3的MRS平板上，于37℃培養(yǎng)24 h。挑取肉眼可見、生長較快、單個(gè)有溶鈣圈、呈黏液狀的菌落，分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌待選菌株，經(jīng)反復(fù)劃線分離培養(yǎng)，直至獲得純菌落為止，將其編號(hào)后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

將上述備用乳酸菌分別接種于滅菌后的全脂水牛乳中，37℃增菌培養(yǎng)活化，再以5%體積量分別轉(zhuǎn)接入20 mL滅菌水牛乳中，每菌株2個(gè)平行樣，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3.3產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化鑒定：將分離保存的菌種劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)及大小、顏色、邊緣及隆起狀況，在生化顯微鏡下觀察革蘭氏染色后的菌體形態(tài)特征。并考察菌株的生長溫度（4℃、10℃、15℃、45℃）、耐酸堿性（37℃條件下pH 4.5及pH 9.6）以及耐鹽性（37℃條件下NaCl 6.5%及18%，在此條件下能生長），同時(shí)進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)及碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)［5］。

菌株的API試劑鑒定：采用API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)未知產(chǎn)EPS的株乳酸菌進(jìn)行鑒定。取適量經(jīng)過活化后的菌液于API 50 CHL液體培養(yǎng)基中，搖勻，接入API 50 CH試劑條中，用滅菌后的液體石蠟封口，30℃培養(yǎng)24 h或48 h觀察試劑條顏色的變化，最后通過API LAB Plus V5.0軟件鑒定菌種。

1.3.4含EPS水牛乳酸奶的制作及其pH和黏度的測定

全脂水牛乳于95℃條件下滅菌12 min，冷卻至37℃，無菌條件下，按8%接種量分別接種活化好的產(chǎn)EPS乳酸菌菌種，于42℃發(fā)酵至凝固，置4℃冰箱后熟24 h備用。分別記錄其凝乳時(shí)間，觀察其色澤及組織狀態(tài)，并測定酸奶的pH和黏度［6-7］。

1.3.5測定方法

黏度的測定：NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，采用3號(hào)轉(zhuǎn)子，30轉(zhuǎn)/min，黏度計(jì)算公式為：η=K·α，其中，η為黏度，K為系數(shù)，α為指針?biāo)缸x數(shù)（偏轉(zhuǎn)量）。

樣品EPS產(chǎn)量的測定：采用苯酚-硫酸法［8］測定發(fā)酵乳中EPS的含量。取10 mL純菌株發(fā)酵乳樣品，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的三氯乙酸，12 000 r/min離心40 min，除去菌體和蛋白，將離心后的上清液裝入透析袋中流水透析48 h。透析液中加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，在4℃冷藏過夜，多糖呈現(xiàn)絮狀沉淀析出，4℃、10 000 r/min離心20 min，除上清液，得到沉淀后的胞外多糖［9］。將胞外多糖溶于10mL蒸餾水中，得到EPS的水溶液。取2 mL樣品液于25 mL比色管中，加入6%的苯酚2 mL，再加入10 mL濃硫酸，在波長625 nm處測定吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.887 8x-0.022 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7，表明葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2乳酸菌的分離及其菌落特征、細(xì)胞形態(tài)

本試驗(yàn)共分離了10株乳酸菌，因乳酸菌在生長過程中產(chǎn)酸較多，故在添加了CaCO3的MRS平板上，菌落周圍有較清晰的溶鈣圈，一般乳球菌表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，凸起，灰白色或白色；乳桿菌表面呈雪花狀，半透明，扁平，白色或灰白色，有黏性，菌落形態(tài)見圖2。經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察，10株初篩乳酸菌中有2株球菌，編號(hào)LB1～2，8株桿菌，編號(hào)為LB3～10，乳桿菌的細(xì)胞形態(tài)為長桿狀或短桿狀，大多呈短鏈或長鏈排列；乳球菌多為圓形，以單生或短鏈狀排列，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)；其細(xì)胞形態(tài)桿菌與球菌各取一株典型菌株進(jìn)行鏡檢，結(jié)果如圖3所示。

圖2　乳酸菌LB2在MRS平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of lactic acid bacteria LB2 in MRS tablet

圖3　初篩乳酸菌的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology of preliminary screened lactic acid bacteria

2.3高產(chǎn)EPS乳酸菌菌株的篩選

將分離所得的10株未知乳酸菌活化后，接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，測定其EPS產(chǎn)量，以取高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌作為下一步優(yōu)選菌株鑒定作參考。結(jié)果如表1所示。

表1　分離乳酸菌菌液的EPS產(chǎn)量Table 1 EPS production of separated lactic acid bacteria liquid

由表1可知，在同等底物和培養(yǎng)條件下，10株乳酸菌均能產(chǎn)EPS，且不同乳酸菌菌液EPS產(chǎn)量不同，其中LB2和LB7產(chǎn)量最高，分別為135 mg/L和148 mg/L。因此，選擇菌株LB2及LB7作進(jìn)一步鑒定。

2.4高產(chǎn)EPS乳酸菌菌種的鑒定

參照文獻(xiàn)［11-12］，對(duì)分離出的10株乳酸菌中產(chǎn)EPS最高的LB2和LB7兩株菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，借助API鑒定系統(tǒng)，結(jié)果見表2。

表2　兩株高產(chǎn)EPS乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiology and biochemistry identification results of two strains of high yield EPS

從表2菌株的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，LB2、LB7的各項(xiàng)檢測特征分別符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中關(guān)于植物乳酸桿菌和魏斯氏菌的描述，后又通過16S rRNA序列測定［13］，其鑒定結(jié)果：菌株LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesen teroides）。

2.5高產(chǎn)EPS乳酸菌的發(fā)酵性能

將已鑒定的、產(chǎn)EPS最高的兩株LB2和LB7作為目標(biāo)菌種來發(fā)酵水牛乳，并隨機(jī)選擇之前分離出的產(chǎn)EPS較低的菌株LB1及LB8作為對(duì)照，測定其水牛乳酸奶的pH值、凝乳時(shí)間、黏度及EPS產(chǎn)量，結(jié)果如表3所示。

表3　產(chǎn)EPS乳酸菌發(fā)酵水牛乳特性Table 3 Characteristics of buffalo milk fermentation by EPS producing lactic acid bacteria

由表3可知，產(chǎn)EPS的這4株乳酸菌均在11～12 h內(nèi)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，各菌株發(fā)酵水牛乳酸奶的pH值均在3.80左右，說明其產(chǎn)乳酸能力相差不大。但是這4種發(fā)酵乳的黏度及EPS產(chǎn)量差異較大，LB7發(fā)酵的水牛乳酸奶黏度及EPS產(chǎn)量最大，分別為4 050 mPa·s、149 mg/L；LB2次之，分別為3 970 mPa·s、142 mg/L；LB8最小，說明酸奶在發(fā)酵過程中，菌體通過不斷分泌胞外多糖來使水牛乳酸奶的黏稠度增加，這與表3中發(fā)酵水牛乳的黏度與EPS產(chǎn)量呈正相關(guān)一致。乳酸菌所產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)酸奶的質(zhì)地黏度、口感及乳清析出都具有重要意義，同時(shí)也是評(píng)定酸奶感官品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)［14］，亦可作為天然增稠劑和穩(wěn)定劑來使用，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。

3　結(jié)論

試驗(yàn)通過涂布平板、斜面劃線從生水牛乳中分離純化出10株乳酸菌，用MRS肉湯活化培養(yǎng)后，均能發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖（EPS），其中LB2和LB7菌株產(chǎn)量最高，分別達(dá)135mg/L、148 mg/L。

通過生理生化實(shí)驗(yàn)、API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、16Sr RNA序列分析鑒定兩株高產(chǎn)EPS菌株：LB2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），LB7為類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）。

將菌株LB2和LB7分別用來發(fā)酵水牛乳酸奶，通過檢測其黏度、pH、EPS產(chǎn)量，進(jìn)一步證實(shí)了LB2和LB7具有高產(chǎn)EPS和優(yōu)良的發(fā)酵性能。

乳酸菌胞外多糖能賦予發(fā)酵乳制品特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，因能起到安全食品添加劑的作用，而廣泛用于食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及持水等方面［15］。本研究將從水牛乳中分離出來的產(chǎn)EPS乳酸菌應(yīng)用到酸奶的發(fā)酵中，以制備出高產(chǎn)EPS的水牛乳酸奶，為今后水牛乳高附加值功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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Screening and identification of lactiv avid bacteria with hiht yield extravellular polysaccharides

TANG Yan，XIE Fang*，YANG Chengjian，NONG Haoru，F(xiàn)ENG Ling，ZENG Qingkun
（Guangxi Buffalo Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530001，China）

Two lactic acid bacteria strains LB2 and LB7 with high yield extracellular polysaccharides（EPS）were screened from raw buffalo milk.After fermentation in MRS medium，the EPS production in fermentation broth was up to 135 mg/L and 148 mg/L，respectively.Through strains morphological，physiological and biochemical characteristics identification，API bacteria identification system，16S rRNA sequence analysis，the strain LB2 was identified asLactobacillus plantarum，LB7 was identified asWeissella paramesenteroides.The strains were applied to the buffalo milk fermentation，the results showed that LB2 and LB7 were available to ferment milk yogurt，and can effectively increase the viscosity of yogurt and extracellular polysaccharide production.The viscosity and EPS yield of the yogurt was 4 050 mPa·s and 149 mg/L，respectively.

lactic acid bacteria；extracellular polysaccharides；screening；strain identification

Q939

0254-5071（2016）02-0070-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.016

2015-12-04

廣西水牛研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（水牛基1504011）

唐艷（1978-），女，助理研究員，本科，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぁ?/p>

謝芳（1980-），女，實(shí)習(xí)研究員，本科，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與食品微生物技術(shù)。