陳　瑾，閆振麗，繆禮鴻*，劉蒲臨（.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 43003；.車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽 473000）

馬克斯克魯維酵母木薯乙醇發(fā)酵工藝研究

陳瑾1，閆振麗2，繆禮鴻1*，劉蒲臨1
（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室，河南 南陽 473000）

通過單因素試驗對一株耐高溫馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32的木薯乙醇發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，HY32利用木薯發(fā)酵乙醇的最佳工藝條件為料水比1∶5（g∶mL），發(fā)酵時間96 h，接種量11%，發(fā)酵溫度40℃，液化時間1 h，液化溫度95℃，液化酶添加量為20 U/g淀粉，糖化酶添加量為150 U/g淀粉，硫酸銨添加量6 g/L，初始pH=5.0。在此條件下，HY32發(fā)酵木薯酒精度可達(dá)8.90%vol，淀粉利用率與淀粉出酒率分別為87.120%和49.48%，殘?zhí)橇繛?.03 g/L。與未優(yōu)化的初始發(fā)酵條件相比，發(fā)酵醪的酒精度提高了16.65%。

馬克斯克魯維酵母；木薯；乙醇發(fā)酵

木薯（cassava）是一種極具潛力的非糧能源作物，淀粉含量可達(dá)70%以上，被稱為“淀粉之王”［1-2］。木薯由于其產(chǎn)量高、原料成本低等優(yōu)點［3-4］，在我國已被廣泛用作燃料乙醇的發(fā)酵原料［5］。

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）具有耐高溫，安全性好等特點，能夠利用多種底物發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［6-8］。KIM S等［9］利用K.marxianus在37℃進(jìn)行菊芋分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，發(fā)酵76 h后乙醇含量達(dá)到70.2 g/L。YUANGSAARD N等［10］利用庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）在40℃進(jìn)行木薯乙醇發(fā)酵，發(fā)酵24 h后酒精度最高達(dá)7.86%vol，乙醇轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的85.4%。

本研究采用耐高溫馬克斯克魯維酵母在40℃進(jìn)行木薯乙醇發(fā)酵，對乙醇發(fā)酵工藝進(jìn)行了單因素優(yōu)化，為高溫酵母進(jìn)行木薯乙醇發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及樣品

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32［11］：武漢輕工大學(xué)資源與環(huán)境微生物學(xué)實驗室分離保存。

木薯粉（淀粉含量為70.987%，過0.45 mm濾篩）：河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.2試劑

濃鹽酸（分析純）、NaOH（分析純）、葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；液化酶（酶活30×104U/mL）、糖化酶（酶活10×104U/mL）：棗莊市杰諾生物酶有限公司。

3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic，DNS）溶液［12］：市售。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptonedextrose medium）液體培養(yǎng)基［13］：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，蒸餾水1 000 mL。

木薯乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取不同質(zhì)量的木薯粉，加水混合，60℃糊化30 min后升溫至95℃，再添加20 U/g淀粉的液化酶液化1 h；降溫至65℃添加150 U/g的糖化酶糖化30 min。添加適量硫酸銨作為氮源，調(diào)節(jié)pH至5.0，即配成木薯乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2儀器與設(shè)備

DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HZQ-2全溫振蕩器：哈爾濱東聯(lián)科技有限公司；WFG7200紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；7890A氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1木薯乙醇發(fā)酵工藝流程

木薯粉→加水后溫浴糊化→液化（液化酶）→糖化（糖化酶）→添加硫酸銨（氮源）并調(diào)節(jié)pH→接種酵母菌乙醇發(fā)酵

操作要點：稱取37.5 g木薯粉于500 mL三角瓶中，按料水比1∶4加入150 mL蒸餾水，于60℃水浴鍋中糊化30 min。升溫至95℃添加20 U/g的液化酶液化60 min，再降溫至65℃添加150 U/g的糖化酶糖化30 min。上述過程中用玻璃棒不斷攪拌，保證傳質(zhì)均勻，使木薯粉充分液化、糖化。冷卻后加入4 g/L硫酸銨，并調(diào)pH至5.0。按5%接種量接種馬克斯克魯維酵母HY32，于40℃靜置發(fā)酵84 h。在此發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，研究料水比、液化時間、液化溫度、液化酶添加量、糖化酶添加量、硫酸銨添加量、初始pH值、發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度等10個單因素對酒精度的影響。

1.3.2木薯粉中總糖和還原糖的測定

還原糖的提取［14］：稱取3 g木薯粉，加入約30 mL蒸餾水，于50℃條件下恒溫水浴20 min。4 000 r/min離心5 min，收集上清液，濾渣用蒸餾水清洗后離心，收集上清液。將兩次收集到的上清液經(jīng)濾紙過濾，定容至100 mL待用。

總糖的提?。?5］：稱取1 g木薯粉于500 mL圓底燒瓶中，加入30 mL蒸餾水和20 mL6 mol/L的HCl，瓶口接回流冷凝裝置，沸水浴1 h。冷卻后加入一滴酚酞指示劑，用6 mol/L的NaOH中和至微紅色。將燒瓶內(nèi)液體經(jīng)濾紙過濾，收集濾出液，定容至100 mL待用。

用DNS法［12］測定總糖及還原糖含量。

1.3.3酒精度測定

采用氣相色譜法測定［11］。

1.3.4木薯淀粉含量的測定

按照GB 5009.9—85《食品中淀粉的測定》中的方法測定。

1.3.5發(fā)酵參數(shù)的計算［16］

2　結(jié)果與分析

2.1料水比對木薯乙醇發(fā)酵的影響

料水比直接決定了后續(xù)發(fā)酵過程的還原糖含量，還原糖含量過高會對酵母的乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制，而含量偏低則降低酒精度，增加蒸餾成本。因此配制料水比分別為1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）的木薯發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實驗，即150 mL蒸餾水中分別加入50 g、37.5 g和30 g木薯粉，相應(yīng)的還原糖測定值分別為266.7 g/L、200 g/L和160 g/L。結(jié)果（表1）表明，料水比為1∶5（g∶mL）時，發(fā)酵醪酒精度最高達(dá)7.632%vol，淀粉出酒率及淀粉利用率也較高，分別為42.41%和74.69%。因此選用料水比1∶5（g∶mL）作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表1　料水比對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of cassava powder-water ratio on ethanol fermentation of cassava

2.2液化時間對木薯乙醇發(fā)酵的影響

分別比較液化時間為1 h、2 h和3 h對木薯乙醇發(fā)酵的影響，結(jié)果（表2）表明，液化1 h、2 h和3 h的酒精度分別為7.298%vol、7.360%vol和7.090%vol。液化2 h時乙醇發(fā)酵各指標(biāo)比液化1 h和3 h稍高，但差距很小。綜合考慮酒精度和時間因素，選用液化時間為1 h作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表2　液化時間對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 2 Effect of liquefaction time on ethanol fermentation of cassava

2.3液化溫度對木薯乙醇發(fā)酵的影響

表3　液化溫度對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 3 Effect of liquefaction temperature on ethanol fermentation of cassava

分別在90℃、95℃和100℃條件下進(jìn)行液化，結(jié)果（表3）表明，三種液化溫度條件下的酒精度分別為6.884%vol、7.869%vol和7.322%vol。其中液化溫度為95℃時酒精度達(dá)到最大，因此選用液化溫度95℃作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

2.4液化酶添加量對木薯乙醇發(fā)酵的影響

分別添加10 U/g、15 U/g、20 U/g和25 U/g淀粉的液化酶進(jìn)行液化，結(jié)果（表4）表明，液化酶添加量為10～20 U/g淀粉時，酒精度隨液化酶添加量增加而增加，添加量為20 U/g淀粉時酒精度最高且此條件下淀粉出酒率和淀粉利用率也較高；而液化酶添加量達(dá)到25 U/g淀粉時酒精度反而下降。因此選用液化酶添加量20 U/g淀粉作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表4　液化酶添加量對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 4 Effect of α-amylase addition on ethanol fermentation ofcassava

2.5糖化酶添加量對木薯酒精發(fā)酵的影響

分別添加100 U/g、150 U/g、20 0 U/g和250 U/g淀粉的糖化酶進(jìn)行糖化，結(jié)果（表5）表明，糖化酶添加量為150 U/g淀粉時酒精度最高達(dá)7.817%vol，酶添加量超過150 U/g淀粉，酒精度反而降低，因此選用糖化酶添加量150 U/g淀粉作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表5　糖化酶添加量對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 5 Effect of glucoamylase addition on ethanol fermentation of cassava

2.6硫酸銨添加量對木薯乙醇發(fā)酵的影響

表6　硫酸銨添加量對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 6 Effect of ammonia sulfate addition on ethanol fermentation of cassava

為了補(bǔ)充木薯中含氮量的不足，本實驗中添加硫酸銨作為氮源，比較不同添加量對酒精度的影響。結(jié)果（表6）表明，硫酸銨添加量為2～6 g/L時，酒精度隨硫酸銨添加量的增加而增加。硫酸銨添加量為6 g/L時酒精度達(dá)到最大，為6.854%vol。當(dāng)硫酸銨添加量達(dá)到8 g/L時，酒精度反而稍有降低，因此選用硫酸銨添加量6 g/L作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

2.7初始pH值對木薯乙醇發(fā)酵的影響

由于pH＞5.0時會出現(xiàn)嚴(yán)重的雜菌污染，因此分別研究pH4.0、pH4.5和pH5.0三個不同發(fā)酵初始pH值對木薯乙醇發(fā)酵的影響。結(jié)果（表7）表明，初始pH值為5.0時酒精度達(dá)到最高，為6.227%vol。因此選用初始pH值為5.0作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表7　初始pH值對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 7 Effect of initial pH on ethanol fermentation of cassava

2.8發(fā)酵時間對木薯乙醇發(fā)酵的影響

為測定發(fā)酵時間對木薯乙醇發(fā)酵的影響，分別在發(fā)酵60 h、72 h、84 h和96 h取樣測定發(fā)酵醪的酒精度。結(jié)果（表8）表明，在發(fā)酵60～96 h范圍內(nèi)，酒精度隨發(fā)酵時間的增長而增加，發(fā)酵96 h時達(dá)到最高，為7.413%vol，殘還原糖含量最低，因此選用發(fā)酵時間96 h作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

表8　發(fā)酵時間對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 8 Effect of fermentation time on ethanol fermentation of cassava

2.9接種量對木薯乙醇發(fā)酵的影響

表9　接種量對木薯乙醇發(fā)酵的影響Table 9 Effect of inoculum on ethanol fermentation of cassava

接種量分別設(shè)定為2%、5%、8%和11%，比較接種量對木薯乙醇發(fā)酵的影響。結(jié)果（表9）表明，酒精度隨接種量的增大而升高，當(dāng)接種量達(dá)到11%時，酒精度達(dá)到最大，為7.801%vol。因此選用接種量11%作為后續(xù)發(fā)酵的條件。

2.10發(fā)酵溫度對木薯乙醇發(fā)酵的影響

為測定馬克斯克魯維酵母HY32發(fā)酵木薯產(chǎn)生乙醇的最適溫度，分別在34℃、37℃和40℃進(jìn)行乙醇發(fā)酵。結(jié)果（表10）表明，發(fā)酵溫度為40℃時，酒精度達(dá)到最大，為8.784%vol；發(fā)酵溫度為37℃時的酒精度為8.441%，僅次于40℃時的發(fā)酵情況；而34℃發(fā)酵時酒精度最低，僅為6.557%。因此選用發(fā)酵溫度40℃作為后續(xù)發(fā)酵的條件，在此溫度條件下，發(fā)酵速率加快，利于乙醇的產(chǎn)生。

表10　發(fā)酵溫度對乙醇發(fā)酵的影響Table 10 Effect of fermentation temperature on ethanol fermentation of cassava

2.11最適發(fā)酵條件下木薯乙醇發(fā)酵結(jié)果

采用上述實驗得出馬克斯克魯維酵母HY32發(fā)酵木薯產(chǎn)乙醇的最適發(fā)酵條件，即料水比1∶5（g∶mL），發(fā)酵時間96 h，接種量11%，發(fā)酵溫度40℃，液化時間1 h，液化溫度95℃，液化酶用量為20 U/g淀粉，糖化酶用量為150 U/g淀粉，硫酸銨添加量為6 g/L，初始pH值為5.0。在此條件下，馬克斯克魯維酵母HY32發(fā)酵木薯酒精度達(dá)8.903%vol，淀粉利用率與淀粉出酒率分別為87.120%和49.477%，殘?zhí)橇繛?.027 g/L。與相同底物濃度下優(yōu)化前的酒精度（7.632%vol）相比，優(yōu)化后的發(fā)酵醪酒精度提高了16.65%。

3　結(jié)論

本實驗利用馬克斯克魯維酵母HY32進(jìn)行了木薯乙醇發(fā)酵單因素試驗，得出最適宜的發(fā)酵條件為料水比1∶5（g∶mL），發(fā)酵時間96 h，接種量11%，發(fā)酵溫度40℃，液化時間1 h，液化溫度95℃，液化酶用量為20 U/g淀粉，糖化酶用量為150 U/g淀粉，硫酸銨添加量為6 g/L，初始pH值為5.0。在此發(fā)酵條件下，HY32菌株發(fā)酵木薯酒精度達(dá)8.903%vol。馬克斯克魯維酵母HY32具有利用淀粉質(zhì)原料進(jìn)行高溫乙醇發(fā)酵的潛在應(yīng)用價值。

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Ethanol fermentation technology with cassava by Kluyveromyces marxianus

CHEN Jin1，YAN Zhenlin2，MIAO Lihong1*，LIU Pulin1
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China；2.State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology，Nanyang 473000，China）

Raw cassava starch was fermented with a thermotolerant yeast strainKluyveromyces marxianus.The optimum fermentation conditions were obtained∶material-water ratio 1∶5（g∶ml），fermentation time 96 h，inoculum11%，fermentation temperature 40℃，liquefaction time 1 h，liquefaction temperature 95℃，amylase addition 20 U/g，glucoamalase addition 150 U/g，ammonium sulfate 6 g/L，initial pH 5.0.Under the optimum fermentation conditions，87.120%of starch was utilized，and the ethanol content achieved 8.90%vol.Compared with the ethanol production under initial conditions，16.65%more ethanol was generated under the optimized conditions.

Kluyveromyces marxianus；cassava；ethanol fermentation

R155.5

0254-5071（2016）02-0039-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.009

2015-11-13

車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室開放基金資助項目（KFKT2013015）

陳瑾（1989-），女，碩士研究生，研究方向為資源與環(huán)境微生物學(xué)。

繆禮鴻（1965-），男，教授，博士，研究方向為資源與環(huán)境微生物學(xué)。