鄧燕，徐積兄，殷小龍，易敬林，朱偉鋒

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，江西 南昌 330006；4.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌 330006）

論著

NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究*

鄧燕1，徐積兄2，殷小龍1，易敬林3，朱偉鋒4

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒童眼科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，江西 南昌 330006；4.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌 330006）

目的研究NQO 1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)系。方法根據(jù)眼底檢查的結(jié)果，把546例2型糖尿病患者分成糖尿病視網(wǎng)膜病變組（DR組）和糖尿病無(wú)視網(wǎng)膜病變組（NDR組）。采用構(gòu)象差異凝膠電泳對(duì)NQO 1基因C609T多態(tài)性進(jìn)行分型。結(jié)果NQO 1基因C609T多態(tài)性的CC、CT和TT 3種基因型在DR組的頻率分別為29.7%、53.2%和17.1%，在NDR組的頻率分別為28.1%、51.8%和20.1%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2=0.678，P=0.713）。結(jié)論NQO 1基因C609T多態(tài)性與我國(guó)江西漢族2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生無(wú)關(guān)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；依賴(lài)還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶；基因多態(tài)性

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）作為糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，目前已成為工作年齡人群致盲的主要原因之一［1］。DR發(fā)病是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過(guò)程，受多種因素影響［2］，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生密切相關(guān)［3］。依賴(lài)還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］作為影響氧化應(yīng)激的重要酶，其活性與外顯子6上的C609T多態(tài)性（rs1800566）密切相關(guān)。當(dāng)此位點(diǎn)由C轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)時(shí)，NQO1蛋白第187位上的脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸，導(dǎo)致該酶活性明顯降低［4］。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-構(gòu)象差異凝膠電泳［5］（polymerase chain reaction-conformation-difference gel electrophoresis，PCR-CDGE）的方法，對(duì)NQO1基因C609T多態(tài)性與我國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性進(jìn)行了研究，報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2011年6月-2013年3月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院546例糖尿病患者。明確診斷為2型糖尿病（均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)），其中，男性301例，女性245例，年齡30～87歲，平均（59.58±11.24）歲。均為江西地區(qū)漢族人，確診糖尿病時(shí)年齡≥30歲，且相互之間無(wú)血緣關(guān)系。根據(jù)是否合并糖尿病視網(wǎng)膜病變分成兩組：糖尿病視網(wǎng)膜病變組（DR組）和糖尿病無(wú)視網(wǎng)膜病變組（NDR組）。

NDR組滿(mǎn)足以下條件：漢族，年齡≥30歲。散瞳檢眼鏡檢查或小瞳下眼底照相檢查眼底無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他嚴(yán)重全身疾病及急性并發(fā)癥；②非2型糖尿病者；③散瞳下檢眼鏡檢查或小瞳下眼底照相眼底不正常（見(jiàn)DR組）。

DR組滿(mǎn)足以下條件：漢族，年齡≥30歲。散瞳檢眼鏡檢查、小瞳下眼底照相檢查或眼底血管熒光造影顯示：微動(dòng)脈瘤、任一象限中有＞20處視網(wǎng)膜內(nèi)出血、在2個(gè)以上象限有靜脈串珠樣改變、在1個(gè)以上象限有顯著的視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、新生血管形成玻璃體積血或視網(wǎng)膜前出血。以上檢查出現(xiàn)1項(xiàng)即為存在視網(wǎng)膜病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他嚴(yán)重全身疾病及急性并發(fā)癥；②非2型糖尿病者。

對(duì)入組的研究對(duì)象收集臨床資料，包括：性別、年齡、民族、出生地和病程，計(jì)算體重指數(shù)（body mass index，BMI），測(cè)量血壓，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）。測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、餐后2 h血糖（postprandial two-hour blood glucose，2 hBG）、 糖 化 血 紅 蛋 白 （glycosylated hemoglobin，HbA1c）和血脂，包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）及尿酸（uric acid，UA）等。

1.2基因組DNA提取

使用百泰克全血基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA［6］，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，取部分DNA稀釋為大約10 ng/μl作為擴(kuò)增模板。

1.3NQO1基因C609T多態(tài)性分型

用PCR-CDGE的方法對(duì)NQO1基因C609T多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。正向引物：5'-GAAGCCCAGACCAA CTTCTG-3'，反向引物：5'-AGGCTGCTTGGAGCAAA ATA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為247bp。PCR體系為10μl，包含5μl 2×Pfu Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR完成后在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行構(gòu)象差異凝膠電泳分析。

1.4NQO1基因C609T多態(tài)性分型的驗(yàn)證

用PCR-RFLP的方法對(duì)NQO1基因C609T多態(tài)性的分型進(jìn)行驗(yàn)證。PCR體系為10μl，包含5μl 2×Taq Master Mix，10μmol正反向引物各0.2μl，模板1.0μl，ddH2O 3.6μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性20s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。酶切體系為15.5μl，包含其中 10×Buffer R1μl，PCR產(chǎn)物5μl，HinfⅠ0.5μl，ddH2O 9μl。在PCR儀上37℃酶切1 h。用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，酶切產(chǎn)物上樣5μl。當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)為C時(shí)，HinfⅠ不能對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物仍為247 bp。當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)為T(mén)時(shí)，247 bp的PCR產(chǎn)物被HinfⅠ切成2個(gè)片段：120 bp和127 bp（120 bp和127 bp在2%瓊脂糖凝膠上不能分開(kāi)，表現(xiàn)為在100 bp和200 bp之間1條帶）。故酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為1個(gè)較大條帶（247 bp）的樣本為CC基因型，酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為1個(gè)較小條帶（120 bp和127 bp）的樣本為T(mén)T基因型，酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上表現(xiàn)為2個(gè)條帶的樣本為CT基因型。對(duì)55例樣本（約10%）進(jìn)行酶切。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，對(duì)于連續(xù)型數(shù)據(jù)，如不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位數(shù)M（Q25，Q75）表示；符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布時(shí)，兩個(gè)樣本的比較用Wilcoxon rank sum test，多個(gè)樣本的比較用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、基因型頻率分布采用c2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1臨床資料

根據(jù)確立的入組標(biāo)準(zhǔn)，共有546例患者滿(mǎn)足以上條件，其中NDR組388例，DR組158例。兩組患者的年齡、性別、BMI、SBP、DBP、2 hBG、HbA1c、TC、TG、HDL-C和LDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DR組病程長(zhǎng)于NDR組，F(xiàn)BG、Scr、BUN和UA高于NDR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2NQO1基因C609T多態(tài)性的分型結(jié)果

構(gòu)象差異凝膠電泳顯示NQO1基因C609T多態(tài)性表現(xiàn)為3種情況：遷移率快的1條帶、遷移率慢的1條帶和2條帶。見(jiàn)圖1。

圖2為NQO1基因C609T多態(tài)性247 bp的PCR產(chǎn)物電泳圖，PCR產(chǎn)物表現(xiàn)為單一清晰的目的條帶，可以用于酶切分型。

酶切結(jié)果顯示在構(gòu)象差異凝膠電泳上顯示為遷移率快的樣本在酶切時(shí)都未被切開(kāi)，為CC基因型，在構(gòu)象差異凝膠電泳上顯示為遷移率慢的樣本在酶切時(shí)都被切開(kāi)，為T(mén)T基因型，而在構(gòu)象差異凝膠電泳上顯示為2條帶的樣本在酶切時(shí)都有2條帶，為CT基因型。見(jiàn)圖3。

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

從表2可知，NDR組和DR組NQO1基因C609T多態(tài)性均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，表明本研究對(duì)象具有代表性。

2.4NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系

從表3可知，NQO1基因C609T多態(tài)性在NDR組和DR組的基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　兩組樣本的臨床資料比較

2.5NQO1基因C609T多態(tài)性位點(diǎn)與糖尿病患者臨床資料之間的關(guān)系

表4顯示NQO1不同基因型的糖尿病患者的臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　NQO1基因C609T多態(tài)性構(gòu)象差異凝膠電泳

圖2　NQO1基因C609T多態(tài)性PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3　NQO1基因C609T多態(tài)性酶切產(chǎn)物電泳圖

表2　NQO1基因C609T多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)　例（%）

表3　NQO1基因C609T多態(tài)性位點(diǎn)在NDR組和DR組的基因型頻率　例（%）

表4　NQO 1基因型與臨床資料的關(guān)系

續(xù)表4

3　討論

近幾十年來(lái)，受我國(guó)城市化進(jìn)程明顯加快、人口老齡化和生活方式改變等因素的影響，我國(guó)糖尿病患病率顯著增加。最近10年糖尿病流行情況更為嚴(yán)重。根據(jù)2007～2008年我國(guó)14個(gè)城市糖尿病流行病學(xué)的調(diào)查，估計(jì)我國(guó)20歲以上的成年人糖尿病患病率為9.7%，成人糖尿病總數(shù)達(dá)9 240萬(wàn)［7］。我國(guó)可能已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家。糖尿病視網(wǎng)膜病變作為糖尿病嚴(yán)重和常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)慢性過(guò)程，除與血糖控制情況、病程長(zhǎng)短、合并全身其他病變、環(huán)境因素等有關(guān)外，遺傳因素也起了重要作用［8-9］。近期國(guó)內(nèi)外的研究表明有多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有關(guān)［10-11］。視網(wǎng)膜含有較高的多不飽和脂酸，有較高水平的氧攝入量和糖氧化，易于發(fā)生氧化應(yīng)激。研究表明，糖尿病及其視網(wǎng)膜病變患者存在著嚴(yán)重的氧化應(yīng)激［12］。因此有必要研究氧化應(yīng)激相關(guān)基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間的關(guān)系。

依賴(lài)還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶 ［NAD（P）H：quinine oxidoreductase 1，NQO1］是參與氧化應(yīng)激的重要酶，能催化醌雙電子還原反應(yīng)，從而減少活性氧的產(chǎn)生［13］。NQO1基因C609T多態(tài)性是影響NQO1活性最重要的多態(tài)性位點(diǎn)，目前在腫瘤方面的研究較多［14］。有研究認(rèn)為，NQO1基因C609T多態(tài)性與2型糖尿病患者冠心病的發(fā)生相關(guān)［15-16］，但尚無(wú)NQO1基因C609T多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變之間關(guān)系的報(bào)道。

本研究用快速、簡(jiǎn)便、低成本的PCR-CDGE法對(duì)546例2型糖尿病患者的NQO1基因C609T多態(tài)性進(jìn)行分型，結(jié)果表明NQO1基因C609T多態(tài)性各基因型在DR組和NDR組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析NQO1基因C609T多態(tài)性各基因型與糖尿病患者臨床資料之間的關(guān)系，顯示NQO1基因C609T多態(tài)性不同基因型糖尿病患者的臨床資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究認(rèn)為，NQO1基因C609T多態(tài)性可能與我國(guó)江西漢族人群2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生無(wú)關(guān)。而文獻(xiàn)中關(guān)于NQO1基因C609T多態(tài)性與2型糖尿病患者冠心病的發(fā)生有關(guān)［15-16］，可能是因?yàn)镹QO1基因C609T多態(tài)性在糖尿病大血管病變和微血管病變中所起的作用不同。

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（張蕾編輯）

Association of NQO1 gene polymorphism w ith diabetic retinopathy*

Yan Deng1，Ji-xiong Xu2，Xiao-long Yin1，Jing-lin Yi3，Wei-feng Zhu4
（1.Department of Pediatric Ophthalmology，the Second Affiliated Hospital to Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；2.Department of Endocrinology and Metabolism，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；3.Department of Ophthalmology，Affiliated Eye Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330006，China；4.Departmentof Biochemistry and Molecular，Basic Medical College of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

Objective To investigate the association of NQO1 C609T polymorphism with diabetic retinopathy. M ethods Based on the results of direct funduscopy detection，546 patients with type 2 diabetes mellitus were divided into 2 groups:diabetic retinopathy（DR）group and non-diabetic retinopathy（NDR）group.NQO1 C609T polymorphism was genotyped by PCR conformation-difference gel electrophoresis（PCR-CDGE）.Results The frequencies of genotype CC，CT and TT at NQO1 C609T polymorphism in DR group and NDR group were 29.7%，53.2%，17.1%and 28.1%，51.8%，20.1%，respectively.No significant difference in genotype between DR group and NDR group was found（c2=0.678，P=0.713）.Conclusions NQO1 C609T polymorphism may not associated with diabetic retinopathy patientswith type 2 diabetesmellitus in Jiangxi Han nationality.

diabetic retinopathy；NQO1；gene polymorphism

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.008

1005-8982（2016）12-0035-06

2016-01-14

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No：GJJ13165）

朱偉鋒，E-mail：zwf100@163.com