付兆宗，江建明，趙振東，司沙沙，謝清華，劉一濤中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）脊柱骨科，廣東江門 5900；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 5055；江門市中心醫(yī)院生殖中心，廣東 江門 5900

臨床研究

骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素18的炎癥應(yīng)答

付兆宗1，江建明2，趙振東1，司沙沙3，謝清華1，劉一濤1
1中山大學(xué)附屬江門醫(yī)院（江門市中心醫(yī)院）脊柱骨科，廣東江門 529030；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515；3江門市中心醫(yī)院生殖中心，廣東 江門 529030

目的 探討IL-18對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用。方法 取骨關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。不同濃度的IL-18（0，50，150，300 ng/mL）刺激軟骨細(xì)胞，RT-PCR檢測TNFα和COX-2 mRNA的表達(dá)，ELISA檢測TNFα、PGE2的水平。應(yīng)用IL-1受體阻斷劑（IL-1Ra）+IL-18干預(yù)軟骨細(xì)胞，檢測軟骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)量和培養(yǎng)液中PGE2的水平。提取軟骨細(xì)胞RNA，測定IL-18受體的表達(dá)。結(jié)果 對(duì)于COX-2和TNFα，300 ng/mL組和150 ng/mL組mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05）。50、300 ng/mL組的PGE2水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。150、300 ng/mL組的TNFα蛋白的濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），IL-1Ra組的PGE2濃度高于對(duì)照組（P＜0.01），但是低于IL-18組（P＜0.01）。軟骨細(xì)胞能夠檢測到IL-18受體的表達(dá)。結(jié)論 IL-18誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生炎癥應(yīng)答，這種作用和IL-1β有關(guān)但不完全依賴IL-1β。

骨關(guān)節(jié)炎；白細(xì)胞介素18；軟骨細(xì)胞；退行性變

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是全球最常見的關(guān)節(jié)疾病，給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。我國OA的發(fā)病率約為4%。60歲以上者膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)49%，每年消耗的醫(yī)療費(fèi)用超過1500億元［3］。因此，早期有效的治療OA具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前OA的治療方法多樣，但是難以阻止病情進(jìn)展，大量患者最終需接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)。雖然手術(shù)能夠一定程度提高生活質(zhì)量，但是給患者帶來較大的創(chuàng)傷和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，且存在血栓形成、關(guān)節(jié)內(nèi)感染、假體松動(dòng)等并發(fā)癥［4-5］。另外，隨著人口平均壽命的延長以及OA發(fā)病的年輕化，平均壽命為10～15年的關(guān)節(jié)假體需慎用于65歲以下的患者。因此，如何針對(duì)OA的發(fā)病機(jī)制，尋找新的、有效的治療方法一直是骨關(guān)節(jié)炎研究領(lǐng)域的熱門課題。

OA是多種炎癥因子參與的關(guān)節(jié)退變疾病。軟骨破壞是其主要病理特征，軟骨碎片進(jìn)入滑液，刺激滑膜引起滑膜炎，滑膜釋放序貫性的炎性介質(zhì)，進(jìn)一步降解軟骨，形成惡性循環(huán)［6］。白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生NO、iNOS、PGE2、MMPs等損傷性的炎癥因子［7］，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)的降解［8-10］。IL-18的結(jié)構(gòu)與IL-1相似，被認(rèn)為是IL-1超家族的一員［11-12］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者的膝關(guān)節(jié)滑液中可以檢測到IL-18的表達(dá)，同時(shí)，RA的關(guān)節(jié)滑膜中也可檢測到IL-18R的存在［13-14］。前人的研究探討了高濃度的IL-18對(duì)RA滑膜細(xì)胞和RA患者外周血單核細(xì)胞的影響，并發(fā)現(xiàn)對(duì)后者的促炎作用更加顯著。但是，IL-18對(duì)OA軟骨細(xì)胞的作用尚未有確切報(bào)道。IL-1能夠誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生和COX-2的基因表達(dá)，并誘導(dǎo)iNOS的產(chǎn)生［15］。但是，IL-1β和IL-18在這種作用中的關(guān)系尚不清楚。本研究探討了IL-18在OA發(fā)病過程中的作用，分析了IL-18和IL-1在促炎作用中的關(guān)系，為OA的靶向治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

實(shí)驗(yàn)所用的軟骨細(xì)胞來自8名OA患者（5女，3男，平均年齡62.3歲）。取材過程獲得患者的知情同意。關(guān)節(jié)軟骨切成2～3 mm3的小塊，DMEM（Gibco，USA）沖洗3次，10%的胰蛋白酶37℃下消化15 min。收集組織，加入0.2%的II型膠原酶（Gibco，USA）和0.1%的透明質(zhì)酸酶（Sigma，USA）37℃搖床消化6 h。除去消化酶，DMEM清洗，無菌細(xì)胞篩過濾。用含10%FBS的DMEM懸浮細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)。檢測軟骨細(xì)胞的特異性膠原——Ⅱ型膠原進(jìn)行細(xì)胞鑒定。原代細(xì)胞接種至六孔板。原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞加入不同濃度的IL-18（0、50、150和300 ng/mL）孵育48 h，收集上清液，完成ELISA檢查。提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。

為進(jìn)一步研究IL-18和IL-1的炎癥誘導(dǎo)作用，取5例軟骨細(xì)胞分為3組：對(duì)照組不加干預(yù)，IL-18組加入100 ng/mL的IL-18，IL-1Ra（IL-1受體抑制劑）組軟骨細(xì)胞加入100 ng/mL的IL-18和IL-1Ra（R&D，USA），孵育24 h。收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測PGE2的水平。

1.2細(xì)胞免疫化學(xué)檢測

8 mm×8 mm載玻片泡酸并消毒后放入六孔板，接種軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，完成爬片。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，每次3 min。3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，動(dòng)物血清封閉非特異性蛋白。去除殘留血清，加入II型膠原兔多克隆抗體（Boster，China），放入濕盒中4℃過夜。加入羊多克隆抗體（Boster，China），37℃孵育30 min。加入辣根過氧化物酶底物和DAB顯色劑，倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3細(xì)胞因子檢測

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液至1.5 mL離心管，3000 g/min離心后放-80℃低溫冰箱保存，集中測定細(xì)胞因子濃度。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），根據(jù)試劑盒廠家的說明書（PGE2:Uscn Life，China；TNFα:Cusabio，China）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PGE2和TNFα的濃度。

1.4RT-PCR檢測

應(yīng)用Trizol（Invitrogen，USA）裂解培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，提取總RNA。260 nm分光光度計(jì)（NanoDrop，Wilmington，USA）測定mRNA濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Toyobo，Japan）（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（Applied biosystems，F(xiàn)oster City，CA）。反應(yīng)條件：30℃-10 min，42℃-20 min，95℃-5 min。應(yīng)用ABI7500 PCR（Applied biosystems，F(xiàn)oster City，CA）系統(tǒng)完成定量PCR。雙delta Ct法進(jìn)行定量分析［16］。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。取4例患者軟骨細(xì)胞，參考Moller等的研究檢測IL-18Rα和IL-18Rβ的表達(dá)［17］。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞因子的濃度及mRNA水平均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同濃度IL-18對(duì)軟骨細(xì)的胞影響采用多樣本比較的方差分析，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則采用LSD法或者Dunnetts'T3（方差不齊時(shí)）進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞的形態(tài)觀察和鑒定

接種后1 d軟骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形，透光度高（圖1A），細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后成多邊形，核大（圖1B）。軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原染色陽性，細(xì)胞間分布有網(wǎng)狀的Ⅱ型膠原（圖1C），對(duì)照組未見Ⅱ型膠原陽性染色（圖1D）。

2.2RT-PCR和ELISA檢測炎癥因子的水平

隨著IL-18濃度的升高，COX-2和TNFα的mRNA表達(dá)量升高（圖2）。無論是COX-2還是TNFα，300 ng/mL組和150 ng/mL組的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05）。檢測不同濃度IL-18干預(yù)下，炎癥蛋白的水平（表1）。50 ng/mL組、150 ng/mL組和300 ng/mL的PGE2濃度分別為410.03±22.97、460.38±112.86、518.28± 38.80 pg/mL，均高于對(duì)照組（340.47±22.03 pg/mL，P= 0.003，P＜0.001和P＜0.001，圖3A）。同樣，與對(duì)照組相比，150 ng/mL組和300 ng/mL組的TNFα（52.45±10.93 pg/mL和103.80±22.29 pg/mL）顯著增高（P=0.002，P＜0.001，圖3B）。IL-18誘導(dǎo)PGE2和TNFα的增高，呈濃度依賴效應(yīng)。

2.3IL-1Ra對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥應(yīng)答的影響

IL-18干預(yù)下，無論是否加入IL-1Ra，COX-2的表達(dá)上調(diào)（圖4）。對(duì)照組、IL-18組和IL-1Ra組的PGE2濃度分別為140.26±23.63 pg/mL、399.27±70.27 pg/mL和268.16±36.45 pg/mL，IL-18組和IL-Ra組PGE2的水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001，P=0.002），而IL-18組的PGE2濃度顯著高于IL-Ra對(duì)照組（P=0.003，圖4）。

2.4RT-PCR檢測IL-18R的表達(dá)

RT-PCT檢查軟骨細(xì)胞IL-18受體的表達(dá)（圖5）。盡管表達(dá)強(qiáng)度不一致，軟骨細(xì)胞中均可檢測到IL-18Rα的表達(dá)，2例檢測到IL-18β的表達(dá)。圖中呈現(xiàn)的是4例患者軟骨細(xì)胞（B）中IL-18Rα和IL-18β mRNA的表達(dá)。

表1　IL-18干預(yù)后PGE2、TNF-α的水平（，pg/mL）

表1　IL-18干預(yù)后PGE2、TNF-α的水平（，pg/mL）

*P＜0.01 vs PGE2in 0 ng/mL group；#P＜0.01 vs TNF-α in 0 ng/mL group.

TNF-α（n=8）20.48±7.36 25.32±9.55 52.45±10.93#103.80±22.29#Group 0 ng/mL 50 ng/mL 150 ng/mL 300 ng/mL PGE2（n=8）340.47±22.03 410.03±22.97* 460.38±112.86* 518.28±38.80*

3　討論

IL-18誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞的炎癥應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)IL-18能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)TNFα和PGE2，刺激軟骨細(xì)胞生成過量的COX-2。COX-2通過降解花生四烯酸產(chǎn)生PGE2。一旦PGE2過量，將導(dǎo)致軟骨代謝失衡，誘發(fā)軟骨降解［18］。關(guān)節(jié)液中TNFα的水平和OA病情緊密緊密相關(guān)，是OA炎癥進(jìn)展的促進(jìn)因素［19-20］。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞均表達(dá)IL-18Rα，且部分表達(dá)IL-18Rβ。IL-18對(duì)細(xì)胞的刺激依賴于這兩種受體，然后通過NF-κB途徑完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞炎癥應(yīng)答［22］。

IL-18可能通過上調(diào)某些細(xì)胞因子的含量，引起OA的癥狀。TNF-α是OA病理過程中重要的細(xì)胞因子之一，許多研究發(fā)現(xiàn)OA的功能評(píng)分與TNF-α的含量具有相關(guān)性［19，21］。另外，TNF-α和PGE2一起加重OA患者膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹等臨床癥狀。Notoya等［23］也對(duì)IL-18和TNF-α做了部分研究，并發(fā)現(xiàn)，由于IL-18能夠誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，后兩者在對(duì)軟骨細(xì)胞的作用類似于IL-18。IL-18對(duì)軟骨細(xì)胞的影響可能依賴于IL-1或TNFα，或者受到二者的影響［23］。

IL-18和IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞的作用既有交叉又相互獨(dú)立。IL-1β促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子，并分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解，是OA發(fā)病過程中典型的促炎因子［24-25］。IL-18在功能上與IL-1β有相似之處，二者均促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子。然而，IL-1Ra阻斷IL-1β的作用后，IL-18仍然能成功誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥應(yīng)答，但是PGE2和TNFα的水平有所降低。這表明IL-18發(fā)揮作用部分依賴于IL-1β，但并不全依賴于IL-1β。可能與二者的傳導(dǎo)通路有關(guān)。IL-18通過MAPK-p38-AP1途徑和NF-κB途徑促進(jìn)COX-2的產(chǎn)生［26-27］，而IL-1β可以通過p38 APK/c-Fos/AP-1和JAK2/STAT1/2途徑誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。不同的信號(hào)通路導(dǎo)致了IL-18和IL-1β的不同效應(yīng)。

關(guān)節(jié)液主要來自滑膜細(xì)胞的分泌和軟骨細(xì)胞的部分代謝產(chǎn)物，是關(guān)節(jié)軟骨自我更新所依賴的環(huán)節(jié)。OA患者滑膜細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-18，并通過類似自分泌的方式影響滑膜細(xì)胞［28］，總體結(jié)果增加了關(guān)節(jié)液中IL-18的濃度。我們的體外實(shí)驗(yàn)一定程度上模擬了軟骨細(xì)胞在高濃度IL-18的干預(yù)下主要促炎因子的變化，體外特定的干預(yù)有利于剔除活體代謝中的混雜因素。但是，由于正常情況下關(guān)節(jié)液較少，且為倫理學(xué)所限制，目前尚無大樣本的研究確定生理狀態(tài)、病理狀態(tài)下關(guān)節(jié)液中IL-18的濃度。我們體外實(shí)驗(yàn)中干預(yù)濃度的確定一方面參考了前人的研究［29］，另一方面是基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。盡管如此，仍能說明IL-18對(duì)軟骨炎癥代謝活動(dòng)的影響。

IL-18能夠增加典型炎癥因子的表達(dá)，可能處于炎性反應(yīng)的上游。既往的研究表明，IL-1在OA的發(fā)病過程中起重要的作用，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-18對(duì)OA軟骨細(xì)胞的影響可能與IL-1有關(guān)，但是其促炎作用相對(duì)獨(dú)立于IL-1對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。因此，阻斷或抑制IL-18的代謝過程可能對(duì)實(shí)現(xiàn)早期OA的靶向治療具有重要的價(jià)值。

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Inflammatory responses of human osteoarthritic chondrocytes induced by interleukin 18

FU Zhaozong1，JIANG Jianming2，ZHAO Zhendong1，SI Shasha3，XIE Qinghua1，LIU Yitao1
1Department of Spine surgery，Affiliated Jiangmen Hospital of Sun Yat-sen University（Jiangmen Central Hospital），Jiangmen 529030，China；2Department of Spine surgery，Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；3Reproductive center，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen 529030，China

Objective To explore the role of interleukin 18（IL-18）on the osteoarthritis（OA）patients'chondrocytes.Methods Knee cartilage samples were obtained from osteoarthritic patients，and the primary cells were cultured.After stimulated by IL-18（0，50，150，300 ng/mL），chondrocytes were collect to obtain the total RNA，and the supernatant were extracted，too.The mRNA’s expression of COX-2 and TNFα were detected by quantitative RT-PCR and the level of PGE2and TNFα were investigated using ELISA.Besides IL-18，IL-1 receptor inhibitor（IL-1Ra）was also added into the medium of cell culture. COX-2 mRNA and PGE2were respectively determination.IL-18 receptors in chondrocytes were detected by RT-PCR.Results mRNA expression of COX-2 and TNFα in 150 and 300 ng/mLwere both significantly higher than that in control group（P＜0.05）. The level of in 50 and 300 ng/mL group were higher than that in control group（P＜0.01）.While the concentration of TNFα in 150 and 300 ng/mL groups appeared more than that in control group significantly（P＜0.01）.And the density of PGE2in IL-Ra group was significantly more than that in control group，but less than that of IL-18 group.IL-18R can be detected on chondrocytes.Conclusion IL-18 induces inflammatory responses in osteoarthritic chondrocytes and that this effect was related with，although not entirely dependent on，IL-1β.

osteoarthritis；interleukin 18；chondrocytes；degradation

2016-03-03

國家自然科學(xué)基金（30571890）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A030310248）

付兆宗，博士，主治醫(yī)師，E-mail:doctor1999@126.com

江建明，碩士，教授，E-mail:doctor2003@126.com