詹建東，邱前輝，張水興，陳少華，蘇小妹廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學科學院耳鼻喉頭頸外科，放射科，廣東 廣州 50080

基礎研究

小干擾RNA沉默HIF-1α基因表達對對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響

詹建東1，邱前輝1，張水興2，陳少華1，蘇小妹1
廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學科學院1耳鼻喉頭頸外科，2放射科，廣東 廣州 510080

目的 探討CNE1對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響。方法 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染入CNE13細胞中。WB法測定CNE1細胞內(nèi)HIF-1α的表達。流式細胞儀及Hochest熒光染色測定細胞凋亡率的變化。WB法測定CNE1細胞內(nèi)BCL-2的表達。結(jié)果 干擾HIF-1α能有效地促進CNE1細胞的凋亡，同時可下調(diào)BCL-2的表達。結(jié)論體外實驗初步證明HIF-1α基因在人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡方面扮演重要角色，可通過下調(diào)BCL-2的表達來誘導凋亡。

HIF-1α；凋亡；CNE1

實體腫瘤增大到約1～2 mm3時，內(nèi)部會出現(xiàn)乏氧的微環(huán)境，此時惡性腫瘤細胞將產(chǎn)生一系列生物學行為的變化來適應低氧狀態(tài)。缺氧誘導因子-lα（HIF-1α）通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞能量代謝、凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等使腫瘤細胞適應缺氧微環(huán)境，促使腫瘤進展［1-2］。HIF-lα在這些過程中起著中心介導作用，在多種腫瘤細胞中降低HIF-lα的表達可能有抗腫瘤的作用［3-8］。已有研究表明，HIF-lα在鼻咽癌組織中高表達，并與鼻咽癌的病理特征和腫瘤血管生成密切相關［9］。而HIF-lα與鼻咽癌增殖凋亡有無關系尚未有文獻報道。本研究通過小干擾RNA（siRNA）沉默人鼻咽癌細胞系CNE1的HIF-lα基因，檢測細胞凋亡的變化及凋亡相關蛋白表達情況，觀察沉默HIF-lα基因?qū)θ吮茄拾┘毎礐NE1細胞生物學行為的影響。

1　材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

人類鼻咽癌細胞系CNE1（采購于美國標準生物品收藏中心），胎牛血清（采購于杭州四季清公司），DMEM培養(yǎng)基（采購于美國Gibco）。

1.2主要試劑

CCK8試劑盒（采購于碧云天生物技術公），雙染熒光標記凋亡檢測試劑盒（采購于羅氏公司），碘化丙啶與膜聯(lián)蛋白-V（Annexin V-PI）。

1.3實驗方法

1.3.1RNA的干擾 HIF-1αsiRNA與陰性對照siRNA通過上海吉瑪公司設計與合成，篩選出的有效HIF-lα-siRNA靶向HIF-lαmRNA的位點為792-812，正義鏈為5'-GUGAUGAAAGAAUUACCGAAUTT-3'，NC-siRNA片段正義鏈序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'。Opti-MEM從美國Gibco購買，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒從廣州英偉創(chuàng)津有限公司購買。轉(zhuǎn)染前的24 h人鼻咽癌細胞CNE1按1×105/孔接種到培養(yǎng)板內(nèi)，37℃培養(yǎng)過1夜。具體轉(zhuǎn)染操作步驟按轉(zhuǎn)染的操作手冊進行，轉(zhuǎn)染6 h以后將更換低血清（0.5%）DMEM培養(yǎng)液進一步培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48 h消化濃集細胞。

1.3.2WesternBlot測試HIF-1α蛋白質(zhì)的表達 收集空白對照組、陰性對照組與轉(zhuǎn)染HIF-lα-siRNA 48 h的CNE1細胞1×105，用PBS液清洗2遍，將溶解于裂解緩沖液，Triton-X-100 0.5 mL，NaCL 0.438 g，pH8.0的HCL 2.5 mL，1 mol/LTris，加蒸餾水到50 mL。使用時，將0.87 mL裂解液加入1.74/LPMSF50 μL，提取總蛋白質(zhì)。BCA法測定各種樣品種總蛋白質(zhì)的濃度，并調(diào)節(jié)至濃度一致。樣品加10%SDS-PAGE（濃縮膠80V；分離膠120 V）大約2.5 h，恒流200 mA 2 h轉(zhuǎn)印在PVDF膜。封閉液（pH 7.6，0.05%Tween 20，5%脫脂奶粉）室溫封閉2 h后，于一抗（稀釋比例1:500）孵育4℃過夜。二抗體（稀釋比例1:2000）孵育2 h。用TBS洗滌3次，通過超敏發(fā)光液顯光，經(jīng)X感光片感光并顯影定影。內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.3.3AnnexinV-PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞收集轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，PBS清洗以后，用預冷75%乙醇固定過夜，離心去除上清，PBS清洗以后加Rnase溶液，放置室溫避光保存，加入0.06 L的PI，置室溫避光30 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3.4Hochest熒光染色將對數(shù)生長期細胞接種在6孔板，藥物作用48 h用PBS洗滌3次，5 min/次，加入多聚甲醛溶液室溫固定30 min，用PBS洗滌3次，5 min/次，加入hochest33342溶液，在37℃下孵育15 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像，正常的細胞核會呈現(xiàn)出彌散均勻的淡藍色熒光，凋亡的細胞核則會呈現(xiàn)致密濃染的強藍色熒光。

1.4統(tǒng)計學方法

結(jié)果用均數(shù)±標準差表述，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間的差別。由SPSS l3.0軟件進行統(tǒng)計分析，顯著性水平是P＜0.05。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后HIF-1α基因蛋白表達情況

使用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染CNE1細胞在24 h時HIF-1α基因蛋白未受到顯著影響，48、72 h后表達量明顯降低。HIF-1αsiRNA組表現(xiàn)明顯時間依賴性，隨著觀察時間的延長，后一個觀察時間點都較前一個觀察時間點細胞中HIF-1α表達量出現(xiàn)明顯下降。

2.2流式細胞術檢測CNE1細胞的凋亡

研究干擾HIF-1α對細胞凋亡的影響，使用流式細胞術檢測細胞凋亡率。經(jīng)獨立樣本t檢驗分析的結(jié)果表明，通過血清饑餓48 h，干擾組的凋亡率為38.8%；血清血清饑餓72 h，凋亡率為60.1%。相應對照組分別為5.6%、10.2%（P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)提示干擾HIF-1α將使CNE1細胞對血清饑餓誘導凋亡變得更加敏感。

2.3活細胞染色結(jié)果

使用Hochest 33258熒光染料對活細胞染色，通過波長365 nm的熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)對照組細胞核邊界清晰，呈均勻淡藍色的圓形或橢圓形。經(jīng)血清饑餓48 h后都能觀察到細胞具有典型凋亡特征，細胞核邊界清晰，呈亮藍色的半月形、馬蹄形，凋亡細胞染色質(zhì)的邊集、核濃縮或聚集；有的細胞核甚至有3個或以上的熒光碎塊。各組分別隨機計數(shù)200個細胞，轉(zhuǎn)染組凋亡細胞為56.2%，對照組凋亡細胞為12.5%。

2.4轉(zhuǎn)染后HIF-1α基因蛋白對凋亡相關基因的影響

為進一步研究HIF-1α對CNE1細胞凋亡分子的機制，我們在不同時間段檢測HIF-1α的凋亡相關蛋白Bcl2的變化情況。結(jié)果顯示干擾HIF-1α后Bcl2表達下降，且呈時間依賴性。

3　討論

本實驗用經(jīng)證實有效的人工化學合成的HIF-lα-siRNA轉(zhuǎn)染CEN1細胞可以沉默HIF-lα基因的表達，轉(zhuǎn)染CNE1細胞在48 h，72 h后HIF-lα表達量明顯降低。從而為研究HIF-lα與鼻咽癌的關系提供了合適的模型。

HIF-1α是1992年由Semenza等最先在缺氧誘導的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)［10］。近年來研究在大多數(shù)人類正常組織細胞中未檢測到HIF-1α蛋白的表達，但在許多腫瘤細胞中卻存在，且與預后密切相關［11-14］。HIF-1α表達與肺癌T分期、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關表達可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。HIF-1α在正常食管黏膜細胞不會表達，而食管鱗癌細胞的陽性表達率為61.7%，且其陽性表達率隨食管癌腫瘤體積呈正相關，隨組織分化程度降低而增高［16］。HIF-1α在鼻咽癌組織中的表達顯著高于鼻咽慢性炎性組織，與T分期、臨床分期和有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關［17］。HIF-lα在細胞凋亡中的調(diào)控作用存在著兩個不同方面的影響：一方面是抗凋亡作用，HIF-lα可增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達，同時還能與人端粒末端逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因相互作用，誘導活化hTERT，增加端粒酶的活性，延長端粒；另一方面是促凋亡作用，HIF-lα能阻斷P53降解與穩(wěn)定P53、上調(diào)Bcl-2家族促凋亡基因BNIP3等途徑。本研究通過沉默鼻咽癌中HIF-lα的表達來檢查細胞凋亡的情況。在本研究中，我們觀察到：干擾組CNE1細胞在轉(zhuǎn)染HIF-lα-siRNA后48、72 h，凋亡率高于對照組，提示沉默HIF-lα基因能誘導CNE1細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效應。

為了進一步研究沉默HIF-lα基因誘導CNE1細胞凋亡的機制。在本研究中，我們觀察到干擾組Bcl-2的表達下降，且呈時間依賴性，干擾48 h后開始顯著下降。有證據(jù)表明BCL-2必須與其它蛋白如Bax形成異二聚體才能發(fā)揮其生理作用。BCL-2還可以和抑癌基因p53相互作用，間接調(diào)控程序性細胞死亡［18］。因此，我們的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-lα在人鼻咽癌細胞生長過程中起著重要作用。干擾HIF-lα的表達，可通過下調(diào)BCL-2的表達從而誘導細胞凋亡。

［1］吳麗君，趙光明，張雪鵬.缺氧微環(huán)境與腫瘤的關系［J］.中國綜合臨床，2014（7）:782-4.

［2］楊慶強，唐春燕.缺氧與腫瘤惡性演進的關系及其機制探討［J］.重慶醫(yī)學，2015（16）:2174-6.

［3］潘克儉，羅鳳鳴，劉小菁，等.HIF-1α基因表達下調(diào)對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖和VEGF表達的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2007，28（17）: 1583-6.

［4］黃康華.HIF-1α基因干擾抑制大鼠肝癌CBRH7919細胞HIF-1α及VEGF表達的實驗研究［D］.廣州:中山大學，2010.

［5］曾偉.siRNA沉默HIF-1α在缺氧狀態(tài)下對鼻咽癌細胞VEGF表達的影響［D］.廣州:廣州醫(yī)學院，2009.

［6］吳欣愛，孫燕，樊青霞，等.siRNA沉默HIF-1α在缺氧狀態(tài)下對食管鱗癌細胞VEGF表達的影響［J］.腫瘤防治研究，2007，34（10）:743-6.

［7］何志強，范平，王博，等.siRNA沉默HIF-1α在缺氧狀態(tài)下對胰腺癌細胞TLR4表達的影響［J］.中華普通外科雜志，2012，27（6）:475-8.

［8］付振宇，張鴿，黃玉華，等.siRNA沉默HIF-lα基因?qū)η傲邢侔㏄C3細胞生長增殖及凋亡的影響［J］.中國男科學雜志，2014（12）:7-10.

［9］尹中普，孫曉.HIF-1α和GLUT-1在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2015，22（4）:495-9.

［10］Tang CM，Yu J.Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer［J］.J Gastroenterol Hepatol，2013，28（3）:401-5.

［11］Gravdal K，Halvorsen OJ，Haukaas SA，et al.Proliferation of immature tumor vessels is a novel marker of clinical progression in prostate cancer［J］.Cancer Res，2009，69（11）:4708-15.

［12］Cha ST，Chen PS，Johansson G，et al.MicroRNA-519c suppresses hypoxia-inducible factor-1alpha expression and tumor angiogenesis［J］.Cancer Res，2010，70（7）:2675-85.

［13］Ioannou M，Papamichali R，Kouvaras E，et al.Hypoxia inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor in biopsies of small cell lung carcinoma［J］.Lung，2009，187（5）:321-9.

［14］Baba Y，Nosho K，Shima K，et al.HIF1A overexpression is

2016-05-15

詹建東，E-mail:13503043816@139.com