陳 芳， 陳利峰， 劉 琴， 王麗平， 張 宜（解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院.醫(yī)學(xué)實驗科， .中西醫(yī)結(jié)合科， 武漢430070）

改良組織塊法分離培養(yǎng)佐劑性關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞

陳 芳1， 陳利峰2， 劉 琴1， 王麗平1， 張 宜1
（解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院1.醫(yī)學(xué)實驗科， 2.中西醫(yī)結(jié)合科， 武漢430070）

目的 通過改良組織塊細胞培養(yǎng)法，建立一種簡單、可行的佐劑性關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞（FLS）體外培養(yǎng)方法并觀察細胞生物學(xué)特性。方法 通過注射弗氏完全佐劑建立關(guān)節(jié)炎模型，無菌條件下取佐劑性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剔凈后剪成碎塊，用滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分，碎片接種于培養(yǎng)皿，觀察細胞生長狀況及形態(tài)特征。取第3代對數(shù)期細胞，用噻唑藍（MTT）法繪制其生長曲線，并用免疫熒光法檢測波形蛋白的表達情況。結(jié)果 體外培養(yǎng)的佐劑性關(guān)節(jié)炎兔FLS形態(tài)為長梭形纖維樣，符合FLS的生長特征，免疫熒光檢測顯強表達波形蛋白。結(jié)論 改良組織塊法可以分離培養(yǎng)出兔佐劑性關(guān)節(jié)炎成纖樣維滑膜細胞，方法簡便，成功率高，滿足實驗要求。

關(guān)節(jié)炎； 兔； 成纖維樣滑膜細胞（FLS）； 改良組織塊法

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身性免疫性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確，在治療方面亦無特效治療措施［1］。尋找安全、有效緩解RA病情的藥物是目前治療RA的重點［2］。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）動物模型已經(jīng)廣泛用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究和評估潛在的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的臨床應(yīng)用［3］?；け砻嬗?～4層扁平或立方形的上皮樣結(jié)締組織細胞，即為滑膜細胞，成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）為滑膜中最主要的細胞，它參與滑膜增生和組織蛋白酶的分泌， 與RA晚期關(guān)節(jié)損傷有著密切的關(guān)系［4，5］。本研究通過改良組織塊法分離培養(yǎng)佐劑性關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞， 為RA在細胞和分子水平的深入研究以及藥物的篩選提供大量的細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級新西蘭白兔16只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實驗動物養(yǎng)殖場提供［SCXK（鄂）2011-0011］。本實驗在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科動物實驗設(shè)施內(nèi)進行［SYXK（鄂）2014-0082］，飼養(yǎng)間溫度18～24 ℃，相對濕度40%～60%，單籠飼養(yǎng)。

1.2 材料

DMEM-H培養(yǎng)基、PBS均購自美國Hyclone公司； 胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司； TritonX-100、4，6二脒基吲哚（DAPI）、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶均購自碧云天公司； MTT和DMSO均購自美國Amersco公司； 小鼠Vimentin抗體、熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗小鼠IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司； 弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司；倒置顯微鏡、DP70熒光顯微鏡均為日本奧林巴斯公司生產(chǎn)； 生物安全柜為海爾公司生產(chǎn)； CO2細胞培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司生產(chǎn)； 細胞計數(shù)器為香港基因生物醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AA兔模型的建立［6］新西蘭白兔16只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分組為正常組和模型組。稱體質(zhì)量后兔足爪剃毛，測足趾部周徑。模型組初次誘導(dǎo)： 將家兔背部肩胛骨間及雙膝關(guān)節(jié)以下的毛用脫毛劑脫去，每只兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL，同時注射背部4點，每點0.2 mL。加強誘導(dǎo)： 注射后7 d加強注射弗氏完全佐劑1次，右跖部皮下0.4 mL， 背部任意2點，每點注射0.2 mL。造模24 d后觀察足趾部腫脹情況和足關(guān)節(jié)的病變特征，鑒定模型。

1.3.2 AA兔成纖維樣滑膜細胞的分離培養(yǎng) 取AA模型兔一只，耳緣靜脈注射空氣處死。體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸濕膝關(guān)節(jié)，去被毛，體積分?jǐn)?shù)1%碘伏與75%酒精依次消毒，解剖找出關(guān)節(jié)囊，用手術(shù)剪分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的PBS中。移入超凈臺中，用上述PBS洗3次，滅菌濾紙吸掉組織上附著的水分， 剪成1～5 mm3大小， 置入3.5 cm平皿中，每皿7～8塊滑膜組織塊，溫箱內(nèi)放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM-H培養(yǎng)液， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后每皿輕輕補加1 mL上述培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態(tài)并照相。4～5 d后進行首次換液，15～20 d后細胞達到90%融合，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%EDTA的胰酶進行1∶2傳代。

1.3.3 噻唑藍（MTT）法繪制細胞生長曲線 取第3代細胞，按1×103/孔接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d隨機取出一組，每孔加入5 mg/mL MTT 25 μL，繼續(xù)孵育4 h形成甲贊結(jié)晶，小心吸棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）125 μL/孔，微量震蕩器震蕩5 min后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于490 nm波長處測定吸光度（A值），繪制細胞生長曲線。

1.3.4 AA兔成纖維樣滑膜細胞鑒定 取第3代細胞，按每孔1×105接種含有爬片的6孔板中，細胞培養(yǎng)48 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液于4 ℃固定30 min。 PBS洗3次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量的Vimentin一抗（1∶100稀釋）并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBS 洗3次，吸水紙吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗小鼠IgG（1∶100稀釋），濕盒中20～37 ℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 AA兔模型的鑒定

造模24 d后觀察，足關(guān)節(jié)及足趾部明顯腫脹（圖1A）； 解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥（圖1B）； 滑膜組織切片HE染色顯示， 正常組的滑膜細胞呈現(xiàn)串珠樣規(guī)則排列（圖1C）， 而模型組的滑膜細胞排列紊亂（圖1D）， 提示AA兔模型制備成功。

2.2 AA兔成纖維樣滑膜細胞形態(tài)觀察

改良組織塊貼壁接種3～6 d，光學(xué)顯微鏡下可見組織塊周圍有大量的亮點，少量細胞從組織塊爬出，有長梭形、圓形和不規(guī)則的多角形，但以長梭形為主（圖2A）。7～9 d，可見大量細胞爬出，細胞形態(tài)以長梭形為主，仍然存在少數(shù)多角形和圓形細胞（圖2B）。9～10 d用1 mL槍頭輕輕吸出組織塊。15～20 d，細胞數(shù)量明顯增多，以典型的長梭形為主，達到90%融合（圖2C）。培養(yǎng)出來的細胞傳至第三代時，可見成纖維細胞樣細胞多單一長梭形且分布均勻（圖2D）。

2.3 AA兔成纖維樣滑膜細胞生長曲線

通過MTT法檢測P3佐劑關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞增殖能力，繪制出來的細胞生長曲線呈現(xiàn)典型的“S”形，并且細胞的活性較強（圖3）。

2.4 AA兔成纖維樣滑膜細胞的鑒定

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，改良組織塊法分離得到的AA兔成纖維樣滑膜細胞表達中胚層組織特征性波形蛋白，用武漢千屏HPIAS-1000彩色圖像采集系統(tǒng)分析細胞的陽性率達98%以上（圖4）。

圖1 新西蘭兔足關(guān)節(jié)及足爪的病變特征Figure 1 Histopathological changes of joints and toes in New Zealand white rabbits

圖2 原代關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞培養(yǎng)（100×）Figure 2 Primary culture of rabbit with adjuvant arthritis fibroblast-like synoviocytes （100×）

圖3 關(guān)節(jié)炎兔成纖維樣滑膜細胞生長曲線Figure 3 The growth curve of fibroblast-like synoviocytes from rabbit with adjuvant arthritis

3 討論

雖然目前對RA的研究已經(jīng)深入到細胞水平、分子水平以及基因水平，但RA的病因和發(fā)病機制極其復(fù)雜，在醫(yī)學(xué)上仍是世界性難題［7］。據(jù)臨床觀察RA的主要病理特征為： 關(guān)節(jié)滑膜炎，滑膜組織增生以及對骨和軟骨的結(jié)構(gòu)性損傷。動物模型是研究RA的重要手段之一， 而比較經(jīng)典的動物造模方法是弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，造模后關(guān)節(jié)炎變化可涉及多個關(guān)節(jié)， 也引起全身癥狀［8］。本研究中將兔作為研究對象，采用多次多點于新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑誘導(dǎo)AA兔模型，造模3周后，外部觀察足關(guān)節(jié)及足趾部明顯腫脹，嚴(yán)重致跛行，解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥，這些表現(xiàn)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相符。

圖4 免疫熒光檢測波形蛋白表達情況Figure 4 The expression of vimentin by immunofluorescence staining

原代細胞培養(yǎng)主要有機械分散法、組織塊培養(yǎng)法和酶消化法［9］。該實驗采用改良組織塊法成功分離培養(yǎng)出兔成纖維樣滑膜細胞，與傳統(tǒng)的組織塊貼壁法相比，最大的優(yōu)點就是大大縮短了組織塊貼壁時間且操作簡單，組織塊置于培養(yǎng)皿之前進行了吸水處理后，只需要放置培養(yǎng)箱5 min后，就可以很牢固貼在培養(yǎng)皿上，之后加一半培養(yǎng)液即可，24 h后補加剩下的一半培養(yǎng)液就行了，而傳統(tǒng)組織塊法由于沒有進行吸水處理，組織塊貼壁時間需要2～4 h，并且貼得不夠牢固，稍微操作不當(dāng)組織塊就會漂浮起來，就很難長出細胞。本實驗培養(yǎng)出的第3代兔成纖維樣滑膜細胞呈現(xiàn)典型的“S”形，與文獻報道［10］一致。傳至5～6代后，細胞逐漸老化，7～8代后活性幾乎喪失，老化停止增殖，建議采用3～4代細胞進行相關(guān)實驗。當(dāng)細胞大量增殖后可置液氮灌中低溫長期保存，為后續(xù)實驗開展提供細胞來源。但在采用改良組織塊法分離培養(yǎng)兔成纖維滑膜細胞的過程中，關(guān)節(jié)滑膜組織的取材最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，直接影響著能否成功培養(yǎng)出所需要的細胞，在實驗前期通過反復(fù)的摸索才掌握滑膜組織的取材方法。

［1］ 唐艷麗， 謝映梅， 王少慧， 等.中藥組方羌活、獨活、防風(fēng)及木瓜聯(lián)合甲氨蝶呤對佐劑性關(guān)節(jié)炎新西蘭白兔TNF-α、IL-1β、VEGF分子及 mRNA的影響［J］.免疫學(xué)雜志， 2014， 30（3）：235-238.

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［Abstrat］ Objective To establish an easier and better method for primary culture of an adjuvant arthritis rabbit fibroblast-like synoviocytes （FLS） by modified tissue cell culture， and then to investigate the biological characteristics of cultured cells.Method The rabbits were injected with Freund's adjuvant complete to establish the model of adjuvant arthritis.The joint synovial layers of rabbits with adjuvant arthritis were cut into small pieces and siphoned off water attached on the tissues with sterile filter paper and then cultured.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rd passage cells was measured by 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide （MTT） assay， and the expression of vimentin tested by immunocytochemistry.Results The in vitro cultured fibroblast-like synoviocytes FLS from rabbit with aduvant arthritis exhibited spindle-shaped appearance and could rapidly expand， and the cells highly expressed vimentin.Conclusion Primary culture of an adjuvant arthritis rabbit FLS by the improved explant culture method is successfully established.The method is simple and high efficient.It can provide a new method for the isolation of FLS.

Isolation and Primary Culture of Fibroblast-like Synoviocytes Using Modified Explant Culture Method from Rabbit with Aduvant Arthritis

CHEN Fang1， CHEN Li-feng2， LIU Qin1， WANG Li-ping1， ZHANG Yi1
（1.Department of Medical Experiments； 2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command， Wuhan 430070， China）

Arthritis； Rabbit； Fibroblast-like synoviocytes （FLS）； Modified explant culture

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0280-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.007

2016-02-26

湖北省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研課題（2013Z-Y37）； 廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院課題（YZ201422）

陳 芳（1979-）， 女， 碩士， 從事中藥藥理及細胞生物學(xué)研究。E-mail： wpcf401717@163.com

陳利鋒。E-mail： Bee-cheng368@126.com