張超超， 黃小燕， 樊海艇， 潘 裕， 趙 源， 黃珍禎， 孫 濤（上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海201203）

懸液芯片技術(shù)在實(shí)驗(yàn)兔病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

張超超， 黃小燕， 樊海艇， 潘 裕， 趙 源， 黃珍禎， 孫 濤
（上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海201203）

［編者按：由于生物技術(shù)的快速發(fā)展，各種檢測(cè)技術(shù)和手段不斷涌現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體檢測(cè)方法雖然有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但隨著我國(guó)的科學(xué)研究與國(guó)際接軌以及全球化進(jìn)程，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體檢測(cè)需要應(yīng)用新的技術(shù)和手段。本文作者應(yīng)用懸液芯片技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔病原體的嘗試，或可為我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體檢測(cè)提供參考。］

目的 應(yīng)用懸液芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)兔幾種病原體的自然感染情況。方法 從8家實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)單位采購(gòu)80只實(shí)驗(yàn)兔（7家普通級(jí)，1家清潔級(jí)），運(yùn)用懸液芯片技術(shù)進(jìn)行微量、快速、高通量的血清學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 各單位實(shí)驗(yàn)兔病原體感染較為普遍，其中輪狀病毒（ROTA）和呼吸道鞭毛桿菌（CARB）的抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)72.5%和80%、； 呼腸弧III型病毒（REO-3）、腦胞內(nèi)原蟲(chóng)（ECUN）和泰澤氏病原體（CPIL）的抗體陽(yáng)性率為21.25%、17.5%和10%； 而清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)兔只存在腦胞內(nèi)原蟲(chóng)（ECUN）和泰澤氏病原體（CPIL）的感染，所有動(dòng)物均不存在淋巴脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）和弓形蟲(chóng)（TOXO）感染。結(jié)論 應(yīng)用懸液芯片技術(shù)可以快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔病原體。

實(shí)驗(yàn)兔； 懸液芯片技術(shù)； 血清學(xué)； 病原體

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)是保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要技術(shù)手段，北京、上海、湖南等地先后做過(guò)這方面的調(diào)查研究［1-3］。實(shí)驗(yàn)兔作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其動(dòng)物質(zhì)量尤其是微生物學(xué)質(zhì)量必將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［4］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)質(zhì)量檢測(cè)方法在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有明確規(guī)定，但新技術(shù)新方法的應(yīng)用可為常規(guī)檢測(cè)提供參考。

懸液芯片技術(shù)［5］是一種快速、特異、敏感的檢測(cè)新技術(shù)［6-8］，該技術(shù)具有微量、快速和高通量的特點(diǎn)［9］，作者應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)了本地區(qū)幾家單位的實(shí)驗(yàn)兔病原體感染情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)兔由本地區(qū)8家擁有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證的單位提供， 每家10只， 共80只， 均為雄性， 體質(zhì)量2.0～2.5 kg。其中1家為清潔級(jí)，7家為普通級(jí)。

1.2 試劑

多重免疫熒光分析緩沖液（MFIA Assay Buffer）；小牛血清； 防腐劑ProClin300； 初次稀釋液（Primary Diluent）； 磁珠； 兔高免和低免對(duì)照液（RbAsmnt High，RbAsmntLow）； 兔輪狀病毒； 兔非免疫對(duì)照液（Non-immune Rabbit）； Diluent稀釋液； 抗兔抗體和抗倉(cāng)鼠IgG（BAG）； 鏈霉親和素（SPE），以上試劑均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.3 儀器及數(shù)據(jù)處理

Bio-Plex-200懸液芯片系統(tǒng)購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司； 運(yùn)用Workbook軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，該軟件由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清樣品采集 通過(guò)實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈采集1 mL血液樣本， 3 000 r/min離心15 min， 取血清， 置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 操作過(guò)程 制作空白板圖； 每孔加入100 μL多重免疫熒光分析緩沖液濕潤(rùn)整個(gè)測(cè)試板，抽濾；每孔加入50 μL微珠； 加入各對(duì)照樣本和待測(cè)樣本50 μL，用鋁箔包裹， 避光， 置于振蕩器， 600 r/min，60 min，抽濾；每孔加入100 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復(fù)2次； 每孔加入50 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，加入50 μBAG，避光，600 r/min震蕩30 min， 抽濾； 每孔加入100 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復(fù)2次； 每孔加入50 μL多重免疫熒光分析緩沖液， 加入50 μSPE， 避光，600 r/min震蕩30 min， 抽濾； 每孔加入100 μL多重免疫熒光分析緩沖液，抽濾，重復(fù)2次； 每孔加入125 μL 多重免疫熒光分析緩沖液，600 r/min震蕩1 min，底部加膜，放入Bio-Plex讀板。檢測(cè)病原體有以下7種： 呼腸?、笮筒《荆≧EO-3）、輪狀病毒（ROTA）、淋巴脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）、腦胞內(nèi)原蟲(chóng)（ECUN）、泰澤氏病原體（CPIL）、呼吸道鞭毛桿菌（CARB）和弓形蟲(chóng)（TOXO）。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，各單位實(shí)驗(yàn)兔病原體抗體陽(yáng)性率的情況較為普遍，其中CARB和ROTA的陽(yáng)性率為80%和72.5%； REO-3、ECUN和CPIL的陽(yáng)性率分別為21.25%、17.5%和10%； 未檢出LCMV和T0X0，具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。

通過(guò)表1可看出，其中1家生產(chǎn)單位的實(shí)驗(yàn)兔（清潔級(jí)）未檢出CARB和ROTA，只有少數(shù)檢出ECUN和CPIL的抗體陽(yáng)性。

而普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔中CARB和ROTA的抗體陽(yáng)性率達(dá)91.4%和72.5%、REO-3、ECUN和CPIL的陽(yáng)性率分別為21.25%、14.29%和7.14%，而LCMV和弓形蟲(chóng)TOXO都未見(jiàn)感染。

表1 各單位實(shí)驗(yàn)兔病原體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)兔作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是實(shí)驗(yàn)研究中一個(gè)必不可少的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)象［10］。本次實(shí)驗(yàn)兔采樣范圍的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)兔病原體抗體陽(yáng)性率較為普遍，其中ROTA和CARB最高，其次REO-3、ECUN和CPIL，但未檢測(cè)到LCMV和TOXO感染。清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)兔沒(méi)有檢測(cè)到普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔存在的主要病原體感染，但還存在ECUN和CPIL的感染［11，12］。說(shuō)明嚴(yán)格的飼養(yǎng)條件是控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的主要手段，其中陽(yáng)性率最高的CARB恰恰與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)也從側(cè)面印證了這點(diǎn)［13］。所以應(yīng)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)兔的飼養(yǎng)管理，并做好實(shí)驗(yàn)兔病原體監(jiān)測(cè)及預(yù)防控制工作。另外，此次檢測(cè)的7種病原體中除了CARB，其余6種病原體在我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中都有列出，但是只有3種為必檢項(xiàng)，是否需要調(diào)整必檢項(xiàng)目，有待商榷。

同時(shí)， 與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比， 懸液芯片技術(shù)體現(xiàn)了微量、快速、高通量的特點(diǎn)［14］。80只實(shí)驗(yàn)兔樣本， 每只動(dòng)物只需采集1 mL血樣， 同時(shí)能對(duì)7種病原體進(jìn)行多重檢測(cè)［15］，所有樣本檢測(cè)時(shí)間只需3～4 h［16］。懸液芯片技術(shù)的成熟應(yīng)用［17］， 可以為實(shí)驗(yàn)兔病原體提供一種新的檢測(cè)方法［18］。該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)在國(guó)外已成熟運(yùn)用于病原體檢測(cè)［19-21］。此次檢測(cè)用試劑是美國(guó)Charles River公司的專利產(chǎn)品， 它是根據(jù)美國(guó)地區(qū)的實(shí)驗(yàn)兔感染特點(diǎn)制定的特殊試劑［22］，其中LCMV和TOXO在此次調(diào)查中均未檢出， 其原因有待進(jìn)一步研究。如果國(guó)內(nèi)能夠開(kāi)發(fā)出適合相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和我國(guó)實(shí)驗(yàn)兔病原體流行情況的專用檢測(cè)試劑， 或可促進(jìn)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

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B

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10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.012

2016-04-01

張超超（1981-）， 男， 實(shí)驗(yàn)師， 從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)及管理。E-mail： stonezcc@163.com

孫 濤（1968-）， 男， 研究員， 研究方向： 病毒與免疫學(xué)。E-mail： tao.sun@sjtu.edu.cn