蘇 紅， 王亞飛， 谷元亮， 趙進(jìn)順， 鄒寶波（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 寧波 315211）

小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型使用與維護(hù)操作

蘇 紅， 王亞飛， 谷元亮， 趙進(jìn)順， 鄒寶波
（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 寧波 315211）

小鼠顯微外科血管插管手術(shù)模型是一種用途廣泛的實(shí)驗(yàn)研究模型， 與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，更接近人體的實(shí)際狀況。但在動(dòng)物模型制作與使用過程中，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程可以確保動(dòng)物模型在統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)下制作、使用與維護(hù)，這樣可以使不同實(shí)驗(yàn)室之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性。因此，在建立活體動(dòng)物模型的同時(shí)，對(duì)模型制作與使用過程中的操作規(guī)程進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)該類模型的推廣使用具有十分重要的意義。

小鼠； 血管插管； 手術(shù)模型； 操作規(guī)程

在生命科學(xué)中，人類的健康和福利研究都離不開動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。醫(yī)學(xué)史上許多科學(xué)家采用動(dòng)物模型獲得重大發(fā)現(xiàn)，如早在1912年Carrel通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，開創(chuàng)了血管與器官移植的實(shí)驗(yàn)研究，并因此獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。然而，很多動(dòng)物模型的制作離不開顯微外科技術(shù)［1］。近年來，顯微外科手術(shù)技術(shù)已經(jīng)在大動(dòng)物（如豬、犬、兔等）［2-4］的活體模型建立中得到了廣泛應(yīng)用，利用大鼠制作動(dòng)物模型的顯微外科手術(shù)研究也很多［5-8］。但是由于大動(dòng)物價(jià)格昂貴，純系品種來源困難，使其應(yīng)用受到了限制。而小鼠因?yàn)榫哂衅废递^純、來源廣、價(jià)格便宜、試劑來源多、免疫學(xué)檢測(cè)方便，且其在食物結(jié)構(gòu)、生理、生化和發(fā)育過程與人類較為接近，小鼠基因和人類基因有大于80%的同源性等優(yōu)點(diǎn)，利用小鼠制作活體動(dòng)物模型進(jìn)行器官移植及心肌梗死等研究的越來越普遍［9-12］。

作者采用顯微外科技術(shù)， 已建立多種小鼠血管內(nèi)活體插管手術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?3，14］， 本文探討在手術(shù)模型使用與維護(hù)過程中的標(biāo)準(zhǔn)化操作及實(shí)驗(yàn)適用條件。

1 手術(shù)后插管的連接

手術(shù)后將動(dòng)脈、靜脈的血管插管分別與微分析旋轉(zhuǎn)輸液閥（美國(guó) Instech laboratories， Inc，型號(hào)375/d/22qm）（圖1）的下端、側(cè)端導(dǎo)管連接。旋轉(zhuǎn)輸液閥上端、側(cè)端再與微量輸液泵（美國(guó) Braintree Scientific， Inc，型號(hào)BS-8000）（圖2）上的注射器相連接。手術(shù)后通過輸液泵持續(xù)不斷地輸入20單位肝素，以保證動(dòng)脈、靜脈插管的通暢。

從旋轉(zhuǎn)輸液閥上引出的動(dòng)脈導(dǎo)管先與一個(gè)Y型導(dǎo)管的下端連接（圖3），導(dǎo)管Y頭一端與微量輸液泵連接，另一端與信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)（美國(guó)DATAG Instruments， Inc.型號(hào)DI720系列）連接。信號(hào)通過軟件轉(zhuǎn)換在計(jì)算機(jī)屏幕上顯示出小鼠的血壓、心率（圖4）。而通過軌跡信號(hào)放大系統(tǒng)則可以顯示動(dòng)脈導(dǎo)管的通暢程度。若發(fā)現(xiàn)軌跡變窄或成一條直線，說明動(dòng)脈導(dǎo)管即將或堵塞。

2 手術(shù)后從動(dòng)脈插管獲取血液標(biāo)本

模型建立后，從靜脈導(dǎo)管注射營(yíng)養(yǎng)成分、藥物與毒物后，需要從動(dòng)脈導(dǎo)管采集血液樣本進(jìn)行分析。通過采集血液標(biāo)本，分離血清檢測(cè)血液中各種成分的變化，分析研究因素的作用。采血方法：用一個(gè)小的血管夾夾住靠近旋轉(zhuǎn)輸液閥插管的一端，將動(dòng)脈插管與旋轉(zhuǎn)輸液閥分開，并與26G針頭的1 mL注射器（內(nèi)含20 U肝素）連接。松開血管夾回抽血液，待血液到達(dá)針頭處停止，再用血管夾夾住插管， 更換另一個(gè)干凈的注射器，松開血管夾回抽100 μL血液（用于實(shí)驗(yàn)研究）。再次夾住插管， 更換先前的注射器，并將血液推還回血管中。最后一次夾住插管，將插管與旋轉(zhuǎn)輸液閥上的導(dǎo)管連接， 即完成了1次從動(dòng)脈插管采血。作者在動(dòng)物手術(shù)后2 d開始從動(dòng)脈導(dǎo)管中采集血液，每日1次，每次100 μL，連續(xù)5 d，觀察小鼠均無異常。

圖1 微分析旋轉(zhuǎn)輸液閥

圖2 微量輸液泵

圖3 Y型導(dǎo)管

圖4 信號(hào)顯示器

3 動(dòng)脈導(dǎo)管采血間隔時(shí)間與采血量

由于小鼠體型較小， 血容量也只有1 mL左右，如果需每日多次采血，又不影響動(dòng)物的健康及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，最佳的采血方法為： 采血后，將離心取得血漿后的血細(xì)胞再用肝素稀釋后重新輸回小鼠體內(nèi)，以免多次抽血而引起動(dòng)物貧血。即在當(dāng)日不同時(shí)間點(diǎn)采血，每次100 μL，分離血漿保存（用于危險(xiǎn)因素的研究等）。分離的血細(xì)胞用20 μL （100 U/mL）肝素生理鹽水混懸后，再回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)。作者在用小鼠做糖鉗夾實(shí)驗(yàn)時(shí)，每10 min采血1次，均按上述方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)持續(xù)4 h，結(jié)果顯示小鼠活動(dòng)均正常。

4 動(dòng)脈管堵塞的相關(guān)因素

動(dòng)物模型建立后最易發(fā)生動(dòng)脈導(dǎo)管堵塞， 其影響因素為： 動(dòng)脈導(dǎo)管的粗細(xì)、導(dǎo)管固定的牢固程度、肝素的給予量和微量注射泵系統(tǒng)是否有氣泡等。

作者在手術(shù)過程中使用不同粗細(xì)的導(dǎo)管，結(jié)果表明內(nèi)徑0.30 mm，外徑0.64 mm的導(dǎo)管較好，太粗不易插入； 太細(xì)雖然方便插入，但易堵塞。

手術(shù)后， 通過輸液泵持續(xù)輸入不同濃度（10 U/mL、20 U/mL、30 U/mL）肝素，以流速12～15 μL/h輸送入動(dòng)脈插管內(nèi)各12例，觀察動(dòng)脈管的堵塞時(shí)間及手術(shù)部位的出血情況，結(jié)果表明，使用濃度為10 U/mL肝素， 動(dòng)脈導(dǎo)管易堵塞； 使用濃度為30 U/mL肝素，手術(shù)部位易出血。使用20 U/mL肝素的條件下，動(dòng)脈導(dǎo)管可以暢通使用6.0±2.5 d。

任何時(shí)間都要注意保持輸液系統(tǒng)管路內(nèi)沒有氣泡。因此，需每日2次檢查計(jì)算機(jī)屏幕，若發(fā)現(xiàn)軌跡變窄或成一條細(xì)線（如圖4屏幕上顯示的第2條細(xì)線），說明該小鼠的動(dòng)脈插管已經(jīng)狹窄或堵塞。若發(fā)現(xiàn)較早，立即用連接26G針頭的1 mL注射器（內(nèi)含20 U肝素）人工沖洗，可能使插管重新通暢，計(jì)算機(jī)屏幕上顯示的壓力軌跡又變寬（如圖4顯示的第1條軌跡）。

5 靜脈導(dǎo)管持續(xù)工作時(shí)間影響因素

待小鼠恢復(fù)正?；顒?dòng)后（一般情況下，術(shù)后2 d即恢復(fù)），用注射泵通過股靜脈持續(xù)注入研究因素。作者分別給予0.9%生理鹽水（200 μL/h）、50%葡萄糖（100 μL/h）和脂肪乳（100 μL/h），觀察3組靜脈導(dǎo)管工作時(shí)間。結(jié)果表明，第1組維持時(shí)間最長(zhǎng)（3周），第3組最短（僅1周），說明靜脈導(dǎo)管持續(xù)工作時(shí)間的長(zhǎng)短與輸入液體的粘稠度有關(guān)。另外，靜脈導(dǎo)管極易因感染而滲漏，從而影響靜脈導(dǎo)管工作時(shí)間。

6 導(dǎo)管系統(tǒng)細(xì)菌污染相關(guān)因素

進(jìn)行該類手術(shù)，最易發(fā)生血液系統(tǒng)的感染。手術(shù)時(shí)無菌程度及術(shù)后旋轉(zhuǎn)輸液閥、微量注射泵系統(tǒng)的潔凈程度，手術(shù)后通過輸液泵持續(xù)輸入液體的無菌狀況等，均是導(dǎo)致感染的危險(xiǎn)因素。

理論上，一例動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)全面更換輸液系統(tǒng)的管路，這是確保系統(tǒng)無菌的最佳辦法。但在實(shí)際工作中，通常難以做到。因?yàn)楦鼡Q一套系統(tǒng)需要增加很多工作量，且更換后的管路經(jīng)常有氣泡存在，管路中的氣泡極易造成動(dòng)脈管的堵塞，使手術(shù)模型失去使用價(jià)值。

因此，在按嚴(yán)格無菌操作技術(shù)規(guī)范進(jìn)行系統(tǒng)處理的狀態(tài)下，觀察管路無菌持續(xù)的時(shí)間，以尋找最佳的管路更換時(shí)間。實(shí)驗(yàn)方法為采集手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)輸液閥動(dòng)、靜脈插管連接處管路中的液體（0.2 mL）進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)（采用涂擦法）， 37 ℃，18～24 h觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，在一切均按嚴(yán)格無菌操作情況下，導(dǎo)管通常可以持續(xù)工作4周而沒有污染（即所有管路均無細(xì)菌生長(zhǎng)）。

7 導(dǎo)管、管路消毒與保潔

手術(shù)前， 對(duì)已經(jīng)制成J型的塑料導(dǎo)管［13，14］以及其他輸液管路的塑料導(dǎo)管用環(huán)氧乙烷（EO）滅菌。對(duì)固定設(shè)備如旋轉(zhuǎn)輸液閥的處理方法為： 先用500 mg/L含氯消毒劑沖洗一遍，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沖洗，最后用0.9%無菌生理鹽水沖洗。每例實(shí)驗(yàn)前，對(duì)旋轉(zhuǎn)輸液閥按上述方法處理以備使用。每4周對(duì)所有管路及微量注射泵系統(tǒng)按同樣方法進(jìn)行清洗消毒。處理后的導(dǎo)管晾干，放入專用包裝袋中EO消毒。

作者的經(jīng)驗(yàn)表明，血液系統(tǒng)的感染多與旋轉(zhuǎn)輸液閥及微量注射泵系統(tǒng)污染有關(guān)。若嚴(yán)格按規(guī)定操作，手術(shù)后小鼠血液系統(tǒng)的感染率較低。若為免疫低下動(dòng)物或手術(shù)后給予免疫抑制劑者，在采血過程中更要嚴(yán)格按無菌技術(shù)操作。

8 小結(jié)與展望

小鼠顯微外科血管插管活體手術(shù)模型是一種用途廣泛的實(shí)驗(yàn)研究模型， 與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比， 其更接近人體的實(shí)際狀況。目前， 國(guó)外研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)開始采用該模型進(jìn)行多方面的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［15-17］，但國(guó)內(nèi)少見該手術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图夹g(shù)建立和應(yīng)用的研究報(bào)道。

1990年代以來，隨著顯微外科技術(shù)發(fā)展，一些以大動(dòng)物為對(duì)象的動(dòng)物模型正在逐漸被小動(dòng)物模型取代［18，19］，以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@微外科實(shí)驗(yàn)研究正在逐年增加。尤其是近年來，小鼠活體血管插管顯微外科技術(shù)已經(jīng)在藥物代謝、糖尿病與肥胖機(jī)理研究中得到應(yīng)用［19，20］。值得注意的是，盡管國(guó)外已經(jīng)有學(xué)者用小鼠活體血管插管手術(shù)模型進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究，但尚缺乏模型標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程及實(shí)驗(yàn)適用條件方面的研究。各實(shí)驗(yàn)室都是按照自己的方法進(jìn)行手術(shù)、術(shù)后維護(hù)及模型動(dòng)物的使用等。鑒于該類模型動(dòng)物是在清醒、自由活動(dòng)與進(jìn)食狀態(tài)下進(jìn)行的連續(xù)動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，手術(shù)的麻醉方式、手術(shù)過程中的失血量多少、手術(shù)中的保暖措施、手術(shù)過程中的無菌技術(shù)、手術(shù)所用的導(dǎo)管粗細(xì)及材質(zhì)材料等均可能對(duì)模型動(dòng)物產(chǎn)生影響。因此，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范可以確保動(dòng)物模型在統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)下制作、維護(hù)與使用，這樣可以使不同實(shí)驗(yàn)室間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性。在建立活體動(dòng)物模型的同時(shí)，對(duì)模型制作過程中的操作規(guī)程進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)該類模型的推廣使用具有十分重要的意義。

在醫(yī)學(xué)研究飛速發(fā)展的今天， 新的藥物和食物不斷開發(fā)成功， 而新的或潛在的毒物也在不斷產(chǎn)生。為確保人類的健康與安全， 研究者需要通過活體動(dòng)物模型對(duì)藥物、毒物、營(yíng)養(yǎng)物等在體內(nèi)的代謝、生理和病理作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察，以探索人類疾病的發(fā)病機(jī)理、藥物的作用機(jī)制、疾病預(yù)防的效果等。隨著我國(guó)科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究要達(dá)到或趕超國(guó)際先進(jìn)水平，建立活體血管插管動(dòng)物模型，提供科研實(shí)驗(yàn)平臺(tái)顯得尤為重要與迫切。

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B

1674-5817（2016）04-0310-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.013

2016-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273111）， 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015C37117， 2015C33148）

蘇 紅（1991-）， 女， 碩士研究生， 研究方向： 勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)。E-mail： suhong0908@126.com

鄒寶波， 副主任技師。E-mail： zoubaobo@nbu.edu.cn