王秀艷

（赤峰學(xué)院　生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古　赤峰　024000）

蕁麻汁體外抑菌作用的初步研究

王秀艷

（赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

研究蕁麻汁對幾種致病菌的體外抑制作用，確定最低及最佳抑菌濃度.通過在固體培養(yǎng)基中添加不同濃度的蕁麻汁，研究其對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌抑菌圈直徑的影響.蕁麻汁濃度在100～700ul/m l范圍內(nèi)對綠膿桿菌，枯草桿菌，金黃色葡萄球菌抑制作用較為顯著；蕁麻汁濃度在700ul/m l時對綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌菌落完全抑制.蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且完全抑制濃度為700ul/m l.

蕁麻汁；綠膿桿菌；枯草桿菌；金黃色葡萄球菌；抑菌作用

狹葉蕁麻（UrticaangustifoliaFisch.ExHornem.）為蕁麻屬多年生野生草本植物，是傳統(tǒng)的可藥可食的野生植物［1］.該植物富含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸及無機元素，其中谷氨酸、天門冬氨酸含量更為突出，是營養(yǎng)價值、保健價值極高的山野菜，可調(diào)節(jié)人們的食物結(jié)構(gòu)，可鮮食、炒食、涼拌、醬菜、烹調(diào)等［2］.

狹葉蕁麻的莖皮纖維可用于紡織或造紙.莖、葉可入藥，能祛風(fēng)、化痞、解毒、溫胃［2］.祛風(fēng)定驚，消食通便.用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，產(chǎn)后抽風(fēng)，小兒驚風(fēng)，小兒麻痹后遺癥，高血壓，消化不良，大便不通；外用治蕁麻疹初起，蛇咬傷［2］.

綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa）或稱銅綠色假單胞菌，它屬假單胞菌屬（pseudomonas）［3］.廣泛存在于自然界，是傷口感染較常見的一種細菌，也是一種致病力較低但抗藥性強的桿菌.綠膿桿菌能產(chǎn)生多種致病物質(zhì)，主要是內(nèi)毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白組胞素等［3］.其致病特點是引起繼發(fā)感染，多發(fā)生在機體抵抗力降低時，如大面積燒傷，長期使用免疫抑制劑等.綠膿桿菌感染可發(fā)生在人體任何部位和組織、常見于燒傷或創(chuàng)傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道［3］.患者感染后可產(chǎn)生特異性抗體，有一定的抗感染作用.臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、敗血癥等［3］.

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種［4］.廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，為條件致病菌，易在枯草浸汁中繁殖，故名枯草芽孢桿菌［5］.枯草芽胞桿菌毒性低，但其可致呼吸道感染、心內(nèi)膜炎，以及菌血癥、敗血癥等.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌”的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染［6］.金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染［6］，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染［7］.

本試驗研究了蕁麻汁對上述三種細菌的體外抑制作用，如獲成功，對人類由上述細菌所引起疾病的預(yù)防和治療具有重大意義.

2　試驗材料與方法

2.1試驗材料

新鮮狹葉蕁麻：（采于赤峰市翁牛特旗）

供試菌：綠膿桿菌，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌（由赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院微生物實驗室提供）

試驗培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂45克，水1000m L.

2.2試驗方法

2.2.1培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：按配方稱取營養(yǎng)瓊脂，加入蒸餾水，加熱，用玻璃棒不斷攪拌至完全溶解，用P H計測其p H為7.3左右（p H用1m o l/L N a O H調(diào)節(jié)），然后置于立式壓力蒸汽滅菌器中121℃滅菌30min，冷卻至60℃取出后在無菌超凈工作臺內(nèi)制備平板培養(yǎng)基，冷卻后備用.

2.2.2菌種擴繁

接種前，將標準菌株及其他所需物品置于超凈工作臺中進行紫外燈殺菌30min.

接種前打開吹風(fēng)，洗凈雙手，伸入超凈工作臺中，用酒精棉擦拭雙手和標準菌株的培養(yǎng)皿外壁，點燃酒精燈，灼燒接種環(huán).然后，將封口膜撕下，左手無名指托住標準菌株培養(yǎng)皿底部，中指和大拇指夾住標準菌株培養(yǎng)皿，食指和大拇指靈活揭開和蓋住培養(yǎng)皿，右手取已平板培養(yǎng)基置于酒精燈前方，左手大拇指在上其余四指在下抓住旋轉(zhuǎn)著灼燒標準菌株培養(yǎng)皿，然后右手拿好接種環(huán)，在火焰上方反復(fù)灼燒幾次接種環(huán)，慢慢伸入標準菌株培養(yǎng)皿中，待溫度不能灼傷菌種時，輕輕刮取菌絲，慢慢將接種環(huán)抽出（注意不要使菌種及菌種環(huán)碰到培養(yǎng)皿內(nèi)壁），小心伸入待接種培養(yǎng)皿培養(yǎng)基中部，涂均勻后慢慢抽出接種環(huán)，勿碰培養(yǎng)皿內(nèi)壁，重復(fù)上述操作.將接好的培養(yǎng)皿貼簽并放在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37±1℃黑暗條件下培養(yǎng)3d，在培養(yǎng)期應(yīng)每6h觀察記錄一次，如有雜菌感染應(yīng)及時將培養(yǎng)皿取出，以免污染其它菌種.在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，長滿整皿后即為二級平板菌種.

2.2.3菌懸液制備

將已擴繁好的二級平板菌種從培養(yǎng)箱中取出，用酒精棉球擦拭后放入超凈工作臺內(nèi)進行紫外燈殺菌，菌懸液配置在超凈工作臺中進行.挑取長勢良好的菌種進行使用，然后將培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿菌種用5m l無菌水將培養(yǎng)基上長出的菌洗脫下來，每種菌液各稀釋至30m l，倒入試劑瓶中，備用.

2.2.4蕁麻汁的制備

將榨汁機放入超凈工作臺，用無菌水將榨汁機沖洗干凈，取新鮮的洗凈的蕁麻放入托盤，一起放入超凈工作臺，然后打開紫外燈，使榨汁機與蕁麻在密閉環(huán)境下紫外滅菌30min.關(guān)閉紫外燈，打開吹風(fēng)，用鑷子夾取幾根蕁麻放入75%酒精中浸泡5～10min進行消毒，后用無菌水反復(fù)沖洗兩到三次，控干水分，放到托盤上.將已消毒清洗后的蕁麻進行榨汁.

2.2.5蕁麻汁濃度設(shè)置

表1　試驗濃度設(shè)置

2.2.6打孔法測定蕁麻汁的抑菌作用

在超凈工作臺內(nèi)用移液槍分別吸取稀釋后的菌液1m l，移入制備好的培養(yǎng)基中，使菌液均勻鋪滿培養(yǎng)基.點燃酒精燈，將滅完菌的打孔器在酒精燈外焰灼燒，待打孔器冷卻后，打開搖勻平鋪好菌液的培養(yǎng)皿，圍繞培養(yǎng)皿培養(yǎng)基中心用打孔器呈正三角形打三孔，然后將打孔器中取出的菌餅棄去，用移液槍將不同濃度的蕁麻汁移入培養(yǎng)基的小孔內(nèi)［11］，每孔移入蕁麻汁為20u l，重復(fù)以上操作.

將移入蕁麻汁的培養(yǎng)皿用封口膜封口后，逐一標記，然后將這些培養(yǎng)皿放入恒溫箱中37℃恒溫培養(yǎng)，每6h觀察記錄一次.

2.2.7抑菌圈直徑的測定

培養(yǎng)3天，選擇抑菌圈的任一位置測量其直徑，然后逆時針旋轉(zhuǎn)60°第二次測量其直徑，接著再逆時針旋轉(zhuǎn)60°進行第三次測量，3個角度測量的平均值為抑菌圈直徑.

3　結(jié)果與分析

表2　不同濃度的蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響

圖1　不同濃度的蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響

3.1蕁麻汁對綠膿桿菌的影響

3.1.1蕁麻汁對綠膿桿菌長勢的影響

圖2　不同濃度的蕁麻汁對綠膿桿菌的影響

由圖2所示，添加不同濃度的蕁麻汁對綠膿桿菌的生長均有抑制作用，且隨著蕁麻汁濃度的升高綠膿桿菌菌體生長速度減慢、長勢減弱.

3.1.2蕁麻汁對綠膿桿菌抑菌圈直徑的影響

表2、圖1分析可由知，當(dāng)蕁麻汁濃度在0～100u l/ml之間時，對綠膿桿菌生長抑制作用較弱，濃度在100～700u l/ml之間時，對綠膿桿菌生長抑制作用較明顯，在該濃度范圍內(nèi)隨著蕁麻汁濃度的升高抑菌圈直徑增大二者呈正相關(guān)，且在濃度為700u l/ml時，綠膿桿菌的抑菌圈直徑達最大.

3.2蕁麻汁對枯草桿菌的影響

3.2.1蕁麻汁對枯草桿菌長勢的影響

圖3　不同濃度的蕁麻汁對枯草桿菌抑菌圈直徑的影響

由圖3所示，添加不同濃度的蕁麻汁對枯草桿菌的生長均有抑制作用.隨著蕁麻汁濃度的升高，枯草桿菌生長速度逐漸減慢、長勢減弱.

3.2.2蕁麻汁對枯草桿菌抑菌圈直徑的影響

由表2、圖1分析可知，當(dāng)蕁麻汁濃度在0～100u l/ml范圍之間時，對枯草桿菌抑制作用較弱，濃度在100～700u l/ml之間時，在該濃度范圍內(nèi)隨著蕁麻汁濃度的升高抑菌圈直徑變大，二者呈正相關(guān)，對枯草桿菌抑制作用較明顯，且在濃度為700u l/m l時，枯草桿菌抑菌圈直徑達最大.

3.3蕁麻汁對金黃色葡萄球菌的影響

3.3.1蕁麻汁對金黃色葡萄球菌長勢的影響

圖5　不同濃度的蕁麻汁對金黃色葡萄球菌的影響

由圖5所示，添加不同濃度的蕁麻汁對生長均受到不同程度影響，隨著蕁麻汁濃度的升高綠膿桿菌生長速度逐漸減慢、長勢減弱.

3.3.2蕁麻汁對金黃色葡萄球菌菌落直徑的影響

由表2、圖1分析可知，當(dāng)蕁麻汁濃度在0～100u l/ml范圍之間時，對金黃色葡萄球菌生長抑制作用較弱，濃度100～700u l/ml之間時，對金黃色葡萄球菌生長抑制作用較明顯，在該濃度范圍內(nèi)隨著蕁麻汁濃度的升高抑菌圈直徑增大，二者呈正相關(guān)，且在濃度為700u l/ml時，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達最大.

4　結(jié)論

4.1在瓊脂平板培養(yǎng)基中加入不同濃度的蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌生長均有不同程度的抑制作用，隨蕁麻汁濃度的升高，綠膿桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑逐漸增大.

4.2蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌最低抑制濃度均為100u l/m L.

4.3蕁麻汁對綠膿桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌完全抑制濃度為700u l/m L.

4.4蕁麻汁濃度在100-700u l/m L范圍內(nèi)，蕁麻汁對三種菌的抑制作用由大到小依次為：枯草桿菌〉金黃色葡萄球菌〉綠膿桿菌.

蕁麻是很有經(jīng)濟價值的野生植物和農(nóng)作物［8］.蕁麻不僅是富含生物學(xué)活性的物質(zhì)［9］，而且我國蕁麻植物資源豐富、分布廣泛，但開發(fā)應(yīng)用不足，市場上以蕁麻原料為主的產(chǎn)品較少，還需要加快對蕁麻植物資源的開發(fā)應(yīng)用［9］.而且，隨著抗生素在臨床的廣泛、大量使用，其濫用和浪費現(xiàn)象也日益增加.過多使用抗生素對細菌產(chǎn)生耐藥性，使抗生素的抗菌作用下降，抗生素在進入人體發(fā)揮治療作用的同時，也會引起很多的不良反應(yīng)，具有較強的副作用，因此，開發(fā)利用蕁麻等天然植物藥代替抗生素具有廣闊的發(fā)展前景.

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2016-05-09