羅　寧，張　森，劉平懷（海南大學(xué)，教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心/熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228）

氮、磷對熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長及油脂積累的影響

羅寧，張森，劉平懷*
（海南大學(xué)，教育部熱帶多糖資源利用工程研究中心/熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口570228）

為研究氮源、氮濃度及磷濃度對一株富油海水藻株Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響。以BG11為基本培養(yǎng)基，考察亞硝酸鈉、硝酸鈉、尿素及氯化銨以及不同尿素濃度和磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長、油脂積累影響。結(jié)果表明：除氯化銨外，不同氮源對Desmodesmus sp.WC08生長影響較小，以尿素為氮源時(shí)，生長和油脂積累最佳；Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的最佳氮濃度為10 mmol/L，過高或過低都將影響其生長和油脂積累；Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂積累隨著磷濃度的升高先增加后降低，最佳磷濃度為0.5 mmol/L；在最佳氮濃度和磷濃度下，Desmodesmus sp.WC08對氮、磷的吸收較完全，能夠充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)。

Desmodesmus sp.WC08，氮源，氮濃度，磷濃度，營養(yǎng)吸收

微藻是一類油脂含量高的微生物，大多數(shù)微藻的油脂含量可達(dá)干重的20%～50%［1］。化石燃料的短缺及其對環(huán)境的污染，使得富油微藻逐漸成為全世界的能源工作者關(guān)注的對象［2］。與傳統(tǒng)的油料作物相比，微藻具有高生長速率，高油脂產(chǎn)率，以及不占用耕地等優(yōu)勢［3］。盡管微藻具有眾多優(yōu)勢，但是高密度培養(yǎng)成本依然是微藻成為商業(yè)化生物柴油原料的瓶頸［4］，因此探索微藻高密度生長和油脂積累的影響因素具有很重要的意義。氮是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的基本組成元素，對微藻的生長和油脂積累具有調(diào)控作用。Scenedesmus sp.CCNM 1077［5］在氮脅迫情況下形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，油脂含量和多糖均達(dá)到最大，分別為干重的27.93%和45.74%。利用污水培養(yǎng)Chlorella sorokiniana［6］，當(dāng)添加尿素為氮源時(shí)生長最好，尿素濃度為1.5 g/L時(shí)，生物量可達(dá)0.218 g/L，油脂含量高達(dá)61.52%。磷參與光合作用，是合成ATP的重要元素之一，對微藻的生長和油脂積累同樣有較大的影響。Rhopalosolen saccatus［7］在磷限制下脂肪酸成分有顯著變化，但是生物量和總脂積累無顯著影響，江淮真等［8］發(fā)現(xiàn)小球藻在缺磷條件下總脂和中性脂含量均逐漸增大。

Desmodesmus sp.WC08是分離自海南島的一株高生物量且油脂含量較高的鏈帶藻，目前對鏈帶藻的研究已有從自然條件［9］（溫度、光照強(qiáng)度、光照周期和pH）及營養(yǎng)元素［10］（鐵、鈣和鎂）優(yōu)化鏈帶藻的培養(yǎng)條件，同時(shí)也可利用污水中的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)鏈帶藻［11］。本研究以Desmodesmus sp.WC08為對象，初步考察氮源、氮濃度及磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響，為Desmodesmus sp.WC08的高密度培養(yǎng)及其油脂開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鏈帶藻（Desmodesmus sp.WC08） 海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供；粗海鹽購自海南鶯歌海鹽場；硝酸鈉、亞硝酸鈉、尿素、氯化銨、磷酸氫二鉀、氯仿及甲醇等均為國產(chǎn)分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用；CR-22G II離心機(jī)日立；LDJ-25C冷凍干燥系統(tǒng)北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO；柱狀玻璃管高60 cm，直徑5 cm。

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基為BG11，每升水中含有1.5 g NaNO3，0.04 g K2HPO4，0.075 g MgSO4·7H2O，0.036 g CaCl2·H2O，0.006 g檸檬酸，0.006 g檸檬酸鐵銨，0.02 g NaCO3，0.001 g EDTA·Na2，2.860 g H3BO3，0.220 g ZnSO4·7H2O，1.810 g MnCl2·4H2O，0.079 g CuSO4·5H2O，0.049 g Co（NO3）2·6H2O，0.390 g Na2MoO4·2H2O。

柱狀培養(yǎng)管中裝0.5 L培養(yǎng)液，接種比例1∶10（V/V），連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為8000～10000 lx，室溫下培養(yǎng)，并通入無菌空氣，通氣比為0.25，培養(yǎng)周期為18 d。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1氮源對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響培養(yǎng)基（除氮源外）按BG11培養(yǎng)基配制，海鹽濃度為15 g/L，分別用BG11配方中相同氮摩爾濃度（18 mmol/L）的硝酸鈉，亞硝酸鈉，尿素和氯化銨作為唯一氮源，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行。

1.3.2氮濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響分別以氮摩爾濃度為5、10、15、20、30 mmoL/L的尿素為氮源，其他成分按BG11培養(yǎng)基配制，海鹽濃度為15 g/L，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行。

1.3.3磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量是影響分別以磷摩爾濃度為0.1、0.3、0.5、0.8、1.2 mmoL/L的磷酸氫二鉀為磷源，其他成分按BG11培養(yǎng)基配制，海鹽濃度為15g/L，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組平行。1.4分析方法

1.4.1生長檢測培養(yǎng)周期為18 d，培養(yǎng)過程中每48 h取樣一次，在680 nm下測定藻液的吸光值。

1.4.2生物量濃度測定將培養(yǎng)18 d后的藻液于8000 r/min離心6 min，將所得藻泥用去離子水清洗3遍，采用真空冷凍干燥法進(jìn)行干燥。生物量濃度計(jì)算公式為：

生物量濃度（g/L）=凍干藻粉（g）/培養(yǎng)液體積（L）1.4.3油脂含量測定參照文獻(xiàn)［12］氯仿-甲醇法對總脂進(jìn)行提取和測定。稱取一定量的凍干藻粉，放入帶塞玻璃管中，加入2 mL的氯仿-甲醇溶液（氯仿∶甲醇為2∶1，v/v），常溫下磁力攪拌30 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液，余下藻渣重復(fù)上述步驟重復(fù)提取一次，合并所有有機(jī)相，加入0.2倍體積的0.9% NaCl，離心分層收集下層氯仿層至干凈玻璃瓶中，氮吹儀吹干至恒重。計(jì)算公式如下：

油脂含量（%）=油脂質(zhì)量（g）/藻粉質(zhì)量（g）×100油脂產(chǎn)量（g/L）=生物量（g/L）×油脂含量（%）

1.4.4氮、磷含量測定總氮按照堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，總磷按照鉬酸銨分光光度法測定。

1.4.5數(shù)據(jù)處理與分析分別采用SPSS 20.0和Oringin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和圖形繪制。

2　結(jié)果與討論

2.1氮源對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

圖1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生長曲線Fig.1　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen sources

微藻對不同形式氮源的吸收利用存在一定的差異，對氮的利用先后順序一般為銨態(tài)氮、其次為硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮［13］。由圖1可以看出，Desmodesmus sp. WC08在以硝酸鈉、亞硝酸鈉、尿素和氯化銨為氮源時(shí)，具有明顯的生長差異。以尿素為氮源時(shí)，生長最快，其次為亞硝酸鈉和硝酸鈉，二者差異較小。以氯化銨為氮源時(shí)，培養(yǎng)7 d后，不再生長且開始死亡，第8 d時(shí)基本全部死亡，其可能由于NH4+的消耗致使培養(yǎng)液pH快速下降導(dǎo)致，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)液pH為3.24，此結(jié)果和以往的研究結(jié)果一致［14］。培養(yǎng)18 d后生物量見表1，尿素組的生物量最高，其次依次為亞硝酸鈉和硝酸鈉組，氯化銨組由于藻體死亡，未能測定生物量。ANOVA分析表明，尿素、硝酸鈉及亞硝酸鈉對Desmodesmus sp.WC08的生物量積累無顯著影響（p＞0.05）。但以尿素為氮源時(shí)，生長最好，生物量最高，可能與尿素不僅能為氮源而且能充當(dāng)碳源有關(guān)。可見，四種不同形式的氮源中，以有機(jī)銨態(tài)氮的尿素最適宜微藻Desmodesmus sp.WC08生長和生物量積累。

表1　Desmodesmus sp.WC08在不同氮源中的生物量濃度Table 1　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp. WC08 with different nitrogen sources

不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂產(chǎn)量見圖2，不同氮源下Desmodesmus sp.WC08的油脂含量無顯著差異（p＞0.05），但是對其油脂產(chǎn)量具有顯著影響（p＜0.05），其中尿素組的油脂產(chǎn)量最高，其次為亞硝酸鈉和硝酸鈉，但后兩者之間無顯著差異（p＞0.05）。以尿素為氮源時(shí)生物量和油脂產(chǎn)量均最大，因此在氮濃度實(shí)驗(yàn)中選擇尿素為氮源。

圖2　氮源對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.2　Effects of nitrogen sources on the lipid accumulation ofmicroalgae Desmodesmus sp.WC08

2.2氮濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

不同濃度的氮源對微藻生長和油脂積累具有非常重要的影響，通常在低氮或缺氮條件下，微藻細(xì)胞較易大量積累油脂，但是生長較差，生物量較低［15-16］。如圖3所示，Desmodesmus sp.WC08在不同濃度氮中的生長具有顯著差異，特別是在生長后期，低濃度氮比高濃度氮更利于Desmodesmus sp.WC08的生長。不同氮濃度對微藻Desmodesmus sp.WC08的生物量積累（表2）具有顯著影響，隨氮濃度升高，生物量逐漸升高，至10 mmoL/L時(shí)，生物量最高，隨后生物量逐漸降低，至氮濃度為30 mmoL/L時(shí)，生物量最低。說明較高的氮濃度對微藻的生長和生物量積累具有一定的抑制作用。氮濃度為10 mmoL/L時(shí)，最有利于Desmodesmus sp.WC08的生長和生物量的積累。

圖3　Desmodesmus sp.WC08在不同氮濃度中的生長曲線Fig.3　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different nitrogen concentrations

除了生長和生物量外，氮濃度對微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累亦具有重要的調(diào)控作用。如圖4所示，氮濃度對Desmodesmus sp.WC08的油脂含量和油脂產(chǎn)量具有極顯著影響，隨著氮濃度升高，油脂含量和油脂產(chǎn)量逐漸降低，氮濃度為5 mmoL/L時(shí)的油脂含量最高，是油脂含量最低的30 mmoL/L組的1.4倍。氮濃度為10 mmoL/L時(shí)，油脂產(chǎn)量最高，5 mmoL/L組次之，二者無顯著差異，是30 mmoL/L組油脂產(chǎn)量的2.2倍。

圖4　氮濃度對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.4　Effects of urea concentration on the lipid accumulation of microalgae Desmodesmus sp.WC08

2.3磷濃度對Desmodesmus sp.WC08生長及油脂含量的影響

磷是除氮元素外，對微藻生長和生化組成最具影響和調(diào)控作用的元素之一。Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度下的生長曲線如圖5所示，不同磷濃度對其生長具有一定差異，磷濃度為0.3 mmoL/L 和0.5 mmoL/L時(shí)，生長最好，低于或高于此濃度范圍后，Desmodesmus sp.WC08的生長較差。最終生物量見表3，磷濃度對Desmodesmus sp.WC08的生物量具有顯著影響，隨著磷濃度的升高，生物量先升高后降低，至濃度為0.5 mmoL/L時(shí)，生物量最高，0.3 mmoL/L次之，二者沒有顯著差異（p＞0.05）。磷濃度為1.2 mmoL/L時(shí)，生物量最低，僅為0.5 mmoL/L時(shí)的一半，說明高濃度磷不利于Desmodesmus sp.WC08的生長。因此，Desmodesmus sp.WC08最適生長和生物量積累的磷濃度為0.5 mmoL/L。

圖5　Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度中的生長曲線Fig.5　Growth curve of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度下的油脂含量和油脂產(chǎn)量如圖6所示，磷濃度對其油脂含量和油脂產(chǎn)量具有極顯著影響，其中在低磷濃度（0.1 mmoL/L）下，Desmodesmus sp.WC08的油脂含量最高，較易積累油脂。在高磷濃度（1.2 mmoL/L）下的油脂含量較低，磷濃度為0.3～0.8 mmoL/L時(shí)，油脂含量無顯著差異。同時(shí)，隨磷濃度升高，油脂產(chǎn)量先升高再逐漸降低，磷濃度為0.5 mmoL/L時(shí)，油脂產(chǎn)量最高，其次為0.3和0.1 mmoL/L，三者無顯著差異，磷濃度為1.2 mmoL/L時(shí)，油脂產(chǎn)量最低，約為0.5 mmoL/L組油脂產(chǎn)量的一半。

圖6　磷濃度對Desmodesmus sp.WC08油脂積累的影響Fig.6　Effects of phosphorus concentrations on the lipid accumulation of microalagae Desmodesmus sp.WC08

2.4Desmodesmus sp.WC08對培養(yǎng)基中的氮、磷的吸收利用

從圖7可以看出，5 mmol/L組和10 mmol/L組的氮源分別在第8 d和第12 d被消耗完，15、20和30 mmol/L組對氮源的利用率較低，在18 d時(shí)的利用率分別是68.82%、58.84%和39.65%。隨著氮濃度的增加氮的利用率逐漸降低，可能是Desmodesmus sp.WC08對氮的吸收存在飽和狀態(tài)，過高的氮濃度反而會抑制Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂積累［2］。圖8所示，磷濃度為0.1、0.3和0.5 mmol/L組磷源分別在4、6和10 d被完全吸收，0.8和1.2 mmol/L組磷源在18 d基本吸收完全。對比氮、磷消耗曲線可以發(fā)現(xiàn)，磷濃度為0.1和0.3 mmol/L組的磷源分別在4和6 d被完全吸收，而對氮的吸收還在繼續(xù)，說明Desmodesmus sp. WC08在一定磷濃度下，對氮的吸收影響較小。對比不同氮濃度的生長曲線和氮消耗曲線可知，當(dāng)?shù)獫舛葹?0 mmol/L時(shí)生物量和油脂產(chǎn)量均最大，且此時(shí)氮消耗完全，而氮濃度在15 mmol/L是生物量和油脂產(chǎn)量均降低，因此氮濃度在10～15 mmol/L范圍內(nèi)繼續(xù)增加可能會促進(jìn)Desmodesmus sp.WC08的生長和油脂的積累。當(dāng)?shù)獫舛葹?0 mmol/L時(shí)，在12 d時(shí)培養(yǎng)基中氮消耗完全，但對比生長曲線發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞仍在增長，說明在缺氮條件時(shí)，藻細(xì)胞能夠利用自身所儲備的氮源，這與張森等［17］的研究結(jié)果一致。

圖7　不同氮濃度下氮的消耗曲線Fig.7　Consumption curves of nitrogen under different nitrogen concentrations

圖8　不同磷濃度下磷的消耗曲線Fig.8　Consumption curves of phosphorus under different phosphorus concentrations

表3　Desmodesmus sp.WC08在不同磷濃度中的生物量Table 3　Biomass concentration of microalgae Desmodesmus sp.WC08 with different phosphorus concentrations

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察了不同氮源、氮濃度及磷濃度對一株熱帶海洋富油微藻Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Desmodesmus sp.WC08在以氯化銨為氮源時(shí)無法正常生長，其他三種氮源（硝酸鈉、亞硝酸鈉和尿素）對Desmodesmus sp.WC08生長和油脂含量影響較小，但對油脂產(chǎn)量有顯著影響。以有機(jī)氮源尿素為氮源時(shí)生物量和油脂產(chǎn)量最高。以尿素為氮源時(shí)，Desmodesmus sp.WC08生物量隨氮濃度升高而升高，油脂含量逐漸降低。當(dāng)?shù)獫舛葹?0 mmol/L時(shí)，油脂產(chǎn)量最高。低氮濃度有助于Desmodesmus sp. WC08細(xì)胞內(nèi)油脂積累，而高氮濃度既不利于生長也不利于油脂積累。隨磷濃度的升高，Desmodesmus sp. WC08的生長和油脂積累先增加后減少，當(dāng)磷濃度為5 mmol/L時(shí)生物量和油脂積累均達(dá)到最大。綜上，四種氮源中，最適合Desmodesmus sp.WC08生長和油脂積累的氮源為尿素且最適濃度為10 mmol/L，最適磷濃度為0.5 mmol/L。

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Effects of nitrogen and phosphorus on cell growth and lipid accumulation of tropic ocean microalgae strain Desmodesmus sp.WC08

LUO Ning，ZHANG Sen，LIU Ping-huai*
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Hainan Provincial Key Lab of Fine Chem，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to study the effects of nitrogen sources and the concentrations of nitrogen and phosphorus on the growth，lipid accumulation of a marine algae Desmodesmus sp.WC08.Four nitrogen sources such as sodium nitrite，sodium nitrate，urea and ammonium chloride and different concentrations of urea and phosphorus were investigated based on the BG11 media.The results showed that different nitrogen sources made little difference to Desmodesmus sp.WC08 except for ammonium chloride.In addition，the growth and lipid accumulation proved to be best when using urea as nitrogen source.Accordingly，the best growth and lipid accumulation which would be easily affected if the concentration of nitrogen was higher or lower，could be obtained at the optimal concentration of nitrogen（10 mmol/L）.Likewise，the growth and lipid accumulation could be obtained at the optimal concentration of phosphorus（0.5 mmol/L）.To be concluded，the nitrogen and phosphorus could be thoroughly absorbed by WC08 and the nutrients in the BG11 media could also be fully used at the their optimal concentrations.

Desmodesmus sp.WC08；nitrogen sources；nitrogen concentrations；phosphorus concentrations；nutrient uptake

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.036

2015－07－21

羅寧（1991-），男，碩士研究生，主要從事微藻培養(yǎng)及其生物活性物質(zhì)方面的研究，E-mail：luoning0615@sina.cn。

劉平懷（1967-），男，碩士，教授，主要從事微藻生物質(zhì)資源方面的研究，E-mail：twlph@163.com。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題（2011BAD14B01）；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項(xiàng)（ZY201327）；國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（13C26244604892）；海南省產(chǎn)學(xué)一體化項(xiàng)目（CXY20150034）。