于志鵬，薛如陽，趙文竹，*，張宏陽，吳　雨，張　霜，勵建榮，劉靜波（.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州203；2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春30062）

肽組學在食源性活性肽研究中應用的進展

于志鵬1，薛如陽1，趙文竹1，*，張宏陽1，吳雨1，張霜1，勵建榮1，劉靜波2，*（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，
遼寧錦州121013；
2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

肽組學作為食品科學技術領域一個新興的重要研究方法，正逐漸應用到生物活性肽制備、純化、結構鑒定以及構效關系研究中，涉及活性肽的定性與定量的各個方面的內容。本文綜述了肽組學在食源性活性肽制備工藝優(yōu)化、特定功能活性的活性肽篩選、活性肽與受體的作用機制以及構效關系等研究的國內外進展，以期為肽組學在活性肽中廣泛深入地應用提供參考。

活性肽，肽組學，純化，結構表征，構效關系

活性肽是一類易于機體吸收并具多種生物活性的物質，其主要來源于動植物蛋白水解［1-4］或微生物發(fā)酵［5-6］，并可被進一步化學修飾。食源性活性肽以其安全無副作用等優(yōu)點，吸引了越來越多的食品科學、生物學、化學及其交叉領域研究人員的研究興趣［7-8］，并已被應用于食品和保健品行業(yè)。目前對于食源性活性肽的研究主要集中在酶解制備、純化和結構鑒定方面：對于制備方法多采用外源蛋白酶進行酶解［9-10］，通過優(yōu)化設計等手段獲得最優(yōu)酶解條件。近年來對于利用內源性蛋白酶進行酶解制備活性肽的研究逐漸興起，利用內源性蛋白酶和外源性蛋白酶協(xié)同酶解制備活性肽的研究也有報道［9-12］，但對于內源性和外源性酶解所制備的活性肽的生理活性的差異對比研究鮮有報道；對于食源性活性肽的純化與結構鑒定，主要通過膜過濾、色譜過濾進行逐級純化，多維色譜純化手段的應用顯著提高了活性肽的純化效率［13-15］。多維色譜純化為獲得高純度的單一肽組分及結構鑒定發(fā)揮了重要作用，但是由于食源性蛋白酶解產物組分復雜，含有成百甚至上千條肽段，而且分子量相近或電荷相等的肽段難以進行分離純化，給后續(xù)的結構鑒定帶來了巨大的難題。目前肽結構鑒定的方法主要為質譜法和化學法，提供單一肽的純化組分是結構鑒定的前提［16-20］。采用逐級分離純化輔以活性跟蹤手段經過多次分離純化和富集獲得單一肽組分最后進行結構鑒定的傳統(tǒng)經典研究路線，一方面工作量大、阻礙了活性肽研究的快速發(fā)展；更重要的是活性跟蹤純化過程中不可避免的將高活性肽序列遺漏，致使最終獲得的活性肽序列僅是最初活性肽復雜體系中活性相對較高的一部分，造成更高活性的活性肽的丟失，因此目前食源性活性肽的高效純化結構鑒定成為獲得完整的高活性活性肽的研究瓶頸，尋求高通量的生物活性肽結構的快速表征方法有助于推進生物活性肽研究的進展。本文綜述了肽組學在活性肽研究中應用的進展情況。

1　肽組學

肽組學（peptidomics）是在蛋白質組學基礎上發(fā)展起來的一個重要分支，是研究低分子量蛋白質和活性肽及其變化規(guī)律的科學，是近些年快速發(fā)展的一種可大規(guī)模表征活性肽的技術［21-24］。目前國際上對于肽組學的研究對象（即低分子量蛋白和活性肽）的分子量還沒有明確的規(guī)定，多數(shù)分子量低于20 ku。肽組（peptidome）為食品原料、產品以及在儲藏加工過程中存在或產生的所有活性肽的集合。肽組學研究內容主要涉及活性肽及其前體蛋白質的結構鑒定、特定功能活性肽的水解條件最優(yōu)化、活性肽結構及其活性的預測以及定量構效關系等［25-26］。肽組學研究對象分為兩類：一類為體內自身存在的活性肽；另一類為蛋白質經特殊水解酶產生的酶解產物。因此，肽組學在食源性活性肽的研究中既可以闡明天然存在的活性肽，又可以表征酶解作用后產生的活性肽結構［25-27］。肽組學研究過程包括樣品前處理、分離純化、目標肽定性、目標肽定量和數(shù)據分析，其中每一個環(huán)節(jié)對于獲得準確肽信息都起著重要作用。肽組學在活性肽的結構表征研究中，主要通過串聯(lián)質譜技術快速高效鑒定新的活性肽的序列，并借鑒肽數(shù)據庫進行檢索和構效關系預測［25-29］。肽組學這一新技術在解決活性肽的高效結構表征領域的應用有望能夠突破活性肽傳統(tǒng)技術所面臨的瓶頸問題。借助肽組學快速、高效的特點，將肽組學技術應用于活性肽活性組分的結構表征是活性肽的未來研究發(fā)展方向之一。

2　肽組學在活性肽制備優(yōu)化中的應用

當前對于食源性活性肽的制備主要利用生物酶解技術，通過對原料中蛋白質進行氨基酸全序列分析或通過蛋白質數(shù)據庫進行檢索獲得原料蛋白的結構信息后，通過利用不同性質蛋白酶進行酶解并跟蹤測定水解度以及目標活性，最終確定所用蛋白酶及所對應的最優(yōu)酶解制備工藝［28-30］。雖然食源性活性肽的酶解制備技術已經相當成熟，但是在篩選過程中需要花費大量的時間，因此尋找一種更為快捷、周期短且能預測出裂解片段活性肽的氨基酸序列的方法將實現(xiàn)對目前研究現(xiàn)狀的突破。肽組學的虛擬酶解數(shù)據庫在活性肽制備優(yōu)化中可以發(fā)揮更多的作用，在利用虛擬酶解數(shù)據庫進行特定蛋白酶的水解需要首先通過蛋白質數(shù)據庫檢索出原料蛋白的分子量和氨基酸序列，常用到的蛋白質數(shù)據庫有UniProt database（http：//www.uniprot.org/），ExPASy（http：//web. expasy.org/）和world wide protein date bank（http：//www. wwpdb.org/）等。在獲得原料蛋白質一級結構的基礎上，利用肽組學技術根據所使用的蛋白酶種類分別進行虛擬水解，常用的蛋白酶有Arg-C proteinase，Asp-N endopeptidase，Asp-N endopeptidase+N-terminal Glu，Caspase1，Caspase2，Caspase3，Caspase4，Caspase5，Caspase6，Caspase7，Caspase8，Caspase9，Caspase10，Chymotrypsin-high specificity（C-term to［FYW］，not before P），Chymotrypsin-low specificity（C-term to ［FYWML］，not before P），Clostripain（Clostridiopeptidase B），Enterokinase，Glutamyl endopeptidase，GranzymeB，Neutrophil elastase，Pepsin（pH1.3），Pepsin（pH＞2），Proline-endopeptidase，Proteinase K，Staphylococcal peptidase I，Tobacco etch virus protease，Thermolysin，Thrombin，Trypsin，這些蛋白酶的選擇可根據篩選活性肽結構特性而定，既可以選擇一種蛋白酶進行水解也可以選擇多種蛋白酶協(xié)同水解。虛擬酶解操作中通過錄入原蛋白序列信息和選擇裂解蛋白酶的種類，便可獲得在此條件下酶解產物的結構信息。Raus等［30］利用protein cutter在線虛擬酶解軟件對蛋白質進行酶解，并對所獲得的肽段分子量、等電點、氨基酸組成以及疏水性進行了分析。計算機虛擬酶解的運用將有利于大規(guī)模篩選食源性蛋白質和特定生物活性肽的前體潛在片段，對于節(jié)省成本和時間發(fā)揮重要作用［31］。

3　肽組學在活性肽結構鑒定中的應用

在過去幾年里，生物活性肽的結構鑒定與表征已發(fā)展成為食源性活性肽研究中新的研究熱點，傳統(tǒng)的生物活性肽結構鑒定的研究思路主要是通過色譜技術、膜技術等進行逐級純化，并在純化過程中進行目標活性的測定跟蹤，不斷收集高活性組分后再進行純化，直到獲得單一活性肽組分后進行一級結構和二級結構分析。側重于研究食品原料中肽的結構組成、相互作用關系和生物活性的肽組學技術在這方面的作用日益突出。高分辨率質譜、計算機模擬水解、構效關系模型、化學計量學和肽數(shù)據庫管理（表1）等作為肽組學的重要部分在食源性活性肽研究中逐漸被廣泛深入地運用［28-29］。這些在線工具的應用以及與當前高靈敏度的生物質譜技術的有機結合為活性肽的結構鑒定提供了解決結構鑒定的難題。目前生物質譜中的液相色譜-飛行時間串聯(lián)質譜以及四級桿線性離子阱質譜開始逐漸應用到生物活性肽結構分析，并輔以質譜數(shù)據解析軟件protein pilot極大的縮短了活性肽結構表征的周期［32-36］。

表1　肽組學研究中的主要工具Table 1　Available tools used in peptidomics

生物活性肽的結構鑒定是后續(xù)構效關系模型、化學計量學分析和肽數(shù)據庫管理的研究基礎。肽組學作為活性肽結構表征的有效策略，主要通過串聯(lián)質譜快速鑒定解析食源性蛋白酶解物中活性肽的結構，目前在乳品及蛋清源活性肽結構鑒定中已有運用［28-29］，其主要研究思路如下：

肽組學技術目前在食源性活性肽中的應用主要集中在乳源和蛋源活性肽的結構鑒定中，Liu等［37-38］借鑒肽組學技術利用三重四級桿線性離子阱串聯(lián)質譜從雞蛋清蛋白酶解產物中高效鑒定出19個活性肽序列，其氨基酸序列分別為RVPSLM，TPSPR，DLQGK，AGLAPY，RVPSL，DHPFLF，HAEIN，QIGLF，HANENIF，VKELY，TNGIIR，KLPGF，EAGVD，EVSGL，NVLQPS，QITKPN，LEPINF，AEAGVD和ANENIF，并通過后續(xù)的生物活性篩選獲得具有抑制血管緊張素轉化酶抑制活性肽RVPSL和抗糖尿病活性肽KLPGF。Wu等［39］利用肽組學中的LC-MS/MS并輔以定量構效關系（QSAR）對大豆蛋白源ACE抑制肽進行了純化和表征，闡明五條三肽序列分別為IVF，LLF，LNF，LSW和LEF。肽組學尤其在乳源蛋白酶解產物的結構鑒定方面應用更為成熟，Laura等［29］對近年來肽組學在乳源生物活性肽的發(fā)現(xiàn)、生物活性篩選以及監(jiān)測等方面的應用進行了報道，并闡明具有一定生理活性肽的一級結構，質譜分析中主要應用ESI、nano ESI、MALDI以及ESI&MALDI離子源，利用IT、TOF以及IT&TOF質量分析器進行結構分析［33-35］，肽組學的一系列應用研究為肽組學在食源性活性肽結構表征中的運用提供了一個成功的參考范例。

4　展望

鑒于食源性生物活性肽已成為功能性食品中重要功效成分且這些化合物的結構和性質的復雜性，科學先進的技術手段對其后續(xù)深入研究發(fā)揮中決定性作用。肽組學技術將會成為食源性生物活性肽研究領域的一個重要手段，因為生物活性肽的純化、結構鑒定、體內吸收分布以及代謝等研究均要涉及肽組學技術。肽組學還可應用于活性肽加工和儲存過程中的變化研究，而多維液相色譜和毛細管電泳色譜與生物串聯(lián)質譜技術協(xié)同跟蹤監(jiān)測活性肽一級結構變化為產品質量溯源提供技術保障。同時肽組學中的生物信息學工具也逐漸應用于食源性生物活性肽的構效關系研究中，可為闡明生物活性肽發(fā)揮生理活性的作用機制提供輔助工具。隨著生物活性肽基礎研究的深入，體內吸收的生物活性肽的濃度以及在靶器官中分布情況的相關性研究將成為未來生物活性肽研究的熱點，肽組學將成為開展這些研究的有效的技術手段，將使感興趣的生物活性肽發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化生產的周期大大縮短，并有助于理解活性肽與受體之間的相互作用機制。

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Progress on the application of peptidomics methods in food-derived bioactive peptides

YU Zhi-peng1，XUE Ru-yang1，ZHAO Wen-zhu1，*，ZHANG Hong-yang1，WU Yu1，ZHANG Shuang1，LI Jian-rong1，LIU Jing-bo2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，China）

Food peptidomics as an emerging field of food science and technology is gradually applied to the biological activity of the peptide preparation，purification，identification，and structure-activity relationship，involved the qualitative and quantitative aspects of bioactive peptides.Objective of this review was to highlight the increasing role of peptidomics as indispensable tool in the fields of production，purification，characterization，and structure-activity relationship of food-derived bioactive peptides，aimed to support extensive application reference of peptidomics in the food-derived peptides field.

bioactive peptide；peptidomics；purification；identification；structure activity relationship

TS201

A

1002-0306（2016）04-0382-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.069

2015－06－12

于志鵬（1984-），男，博士，講師，研究方向：蛋白質及活性肽的功能研究與產品開發(fā)，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

趙文竹（1986-），女，博士，講師，研究方向：植物多糖及糖蛋白，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。劉靜波（1962-），女，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與功能食品，E-mail：ljb168@sohu.com。

國家自然科學基金面上項目（31271907）；國家科技支撐課題-“食源性功能肽生物制備技術研究（2012BAD00B03）”。