張懷斌，徐　暢，邢汝月

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

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D-半乳糖與牛血清白蛋白相互作用的光譜分析

張懷斌，徐暢，邢汝月

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

用光譜法研究了D-半乳糖(D-Gal)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。結(jié)果表明，隨著D-Gal濃度的增大，BSA的熒光光譜發(fā)生猝滅，猝滅機制為靜態(tài)猝滅，且BSA的最大發(fā)射峰藍移；紫外吸收光譜和同步熒光光譜表明，D-Gal使BSA的疏水性增強，骨架變得松散；熱力學(xué)分析表明，疏水作用力是D-Gal與BSA間的主要作用力。

D-半乳糖(D-Gal)；牛血清白蛋白(BSA)；光譜分析；疏水作用力

D-半乳糖(D-Gal)又叫氨基半乳糖，是維持體內(nèi)正常生理活動的營養(yǎng)成分之一，在糖代謝中起重要作用，若過量會導(dǎo)致糖代謝紊亂。而且D-Gal在代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，損傷多種生物大分子(如蛋白質(zhì)、DNA)、改變細胞內(nèi)基因的表達以及機體的調(diào)節(jié)系統(tǒng)、降低細胞轉(zhuǎn)錄水平[1]，導(dǎo)致肝損傷等[2]。牛血清白蛋白(BSA)是體外實驗中重要的模型蛋白[3-5]。作者研究D-Gal與BSA相互作用的光譜變化，以期為D-Gal在藥理、藥效方面的研究提供參考。

1　實驗

1.1試劑與儀器

BSA(純度>98%)，北京奧博星生物有限公司；D-Gal，北京化工廠；其它試劑均為分析純。Tris-HCl緩沖溶液0.1mol·L-1(pH=7.40，NaCl濃度0.05mol·L-1)，BSA溶液的濃度為1.0×10-6mol·L-1；D-Gal水溶液的濃度為1.0×10-3mol·L-1。

LS-55型熒光光譜儀，美國PE公司；T1901型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2方法

將BSA與不同濃度的D-Gal均勻混合，以285nm的光作為激發(fā)光，調(diào)節(jié)激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度比為6∶8，在不同溫度下測定BSA的熒光光譜；在190～300nm范圍測定BSA的紫外吸收光譜。

2　結(jié)果與討論

2.1D-Gal與BSA相互作用的熒光光譜

BSA的熒光主要來源于色氨酸殘基[6]，通過BSA熒光光譜的變化可以判斷藥物小分子對BSA結(jié)構(gòu)的影響和色氨酸殘基周圍疏水腔環(huán)境的微變化[4]。不同濃度的D-Gal對BSA的熒光猝滅光譜見圖1。

1～7，D-Gal濃度(×10-6 mol·L-1)：0,3.3,6.6,9.9,13.2,16.5,19.8

由圖1可知，BSA的最大發(fā)射峰位于350 nm處，隨著D-Gal濃度的增大，BSA的熒光強度不斷減弱，最大發(fā)射峰藍移了4 nm。表明D-Gal對BSA的熒光具有猝滅作用。

2.2D-Gal與BSA相互作用的猝滅機制

熒光猝滅機制分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類，猝滅機制可以通過Stern-Volmer方程F0/F=1+KSVc=1+Kqτ0c來判斷[3](式中：F、F0分別為有、無猝滅劑時的熒光強度；KSV為Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)；c為猝滅劑濃度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τ0為生物大分子的平均熒光壽命，為10-8s)。

圖2為不同溫度下D-Gal與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線，根據(jù)直線斜率求出KSV，進一步求出Kq，結(jié)果見表1。

圖2　D-Gal與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線

表1D-Gal與BSA相互作用的猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)

Tab.1　Quenching constant(KSV) and quenching rate constant(Kq) of the interaction between D-Gal and BSA

由表1可知，Kq遠大于動態(tài)猝滅的最大擴散速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，初步推斷D-Gal對BSA的熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅[4-7]。隨著溫度的升高，二者作用的斜率略有增大，說明動態(tài)猝滅在整個熒光猝滅過程中貢獻微弱。

BSA的猝滅機制還可以通過BSA紫外吸收光譜的變化來判斷，靜態(tài)猝滅時BSA的紫外吸收光譜會發(fā)生改變；動態(tài)猝滅不會發(fā)生變化[5]。圖3為不同濃度的D-Gal與BSA相互作用的紫外吸收光譜。

1～3，D-Gal濃度(μmol·L-1)：0,6.6,13.2

由圖3可知，210 nm附近的吸收峰為BSA骨架的吸收峰，280 nm附近的吸收峰是色氨酸、酪氨酸殘基的吸收峰[8]。由圖3插圖可知，隨著D-Gal濃度的增大，280 nm附近的吸收峰強度略微減弱，且發(fā)生紅移，說明在BSA中加入D-Gal后，二者發(fā)生了相互作用，改變了BSA發(fā)色團周圍的微環(huán)境；隨著D-Gal濃度的增大，210 nm附近的吸收峰強度明顯減弱，并發(fā)生紅移，說明BSA的骨架變得松散[3]。這是因為，D-Gal與BSA生成了基態(tài)復(fù)合物，改變了BSA的吸收光譜。因此，推斷D-Gal對BSA的猝滅機制為靜態(tài)猝滅。

2.3D-Gal與BSA相互作用的同步熒光光譜(圖4)

以285 nm為激發(fā)光，當(dāng)△λ=60 nm時會顯示出色氨酸(Trp)殘基的熒光特性[7]。從圖4可以看出，隨著D-Gal濃度的增大，色氨酸殘基的熒光強度逐漸減弱，最大發(fā)射峰略有紅移；△λ=15 nm時顯示酪氨酸(Tyr)殘基的熒光特性，本實驗條件下，酪氨酸殘基的最大發(fā)射峰的位置和熒光強度沒有明顯變化(圖略)。說明在激發(fā)光波長為285 nm時BSA的熒光主要由色氨酸殘基貢獻，在D-Gal作用下色氨酸殘基所處的微環(huán)境的極性發(fā)生了改變，疏水性增強，從而使得BSA的熒光光譜發(fā)生了變化[7]。

1～7，D-Gal濃度(μmol·L-1)：0,3.3,6.6,9.9,13.2,16.5,19.8;△λ=60 nm

2.4D-Gal與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用符合方程[9]：lg(F0/F-1)=lgKA+nlgc，以lg(F0/F-1) 對lgc作圖(圖5)，可求出D-Gal與BSA的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點數(shù)n，結(jié)果見表2。

圖5　lg(F0/F-1)與lgc的關(guān)系曲線

表2不同溫度下，D-Gal與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

Tab.2　Thermodynamic parameters of interaction between D-Gal and BSA at different temperatures

Ross等[10]研究表明，△H和△S均為正值時，相互之間的作用力主要為疏水作用力；△G小于零，說明二者之間的結(jié)合可自發(fā)進行；△H大于零，表明該結(jié)合作用為吸熱過程，升高溫度，結(jié)合作用增強。從表2可知，△H和△S均為正值，表明D-Gal與BSA之間的主要作用力是疏水作用力。

3　結(jié)論

采用光譜法研究了D-Gal與BSA的相互作用。結(jié)果表明，D-Gal與BSA可以形成基態(tài)復(fù)合物猝滅BSA的內(nèi)源熒光，疏水作用力是其主要作用力，D-Gal能改變BSA色氨酸殘基的微環(huán)境。

[1]BRENNER D A,SIGMUND S.Pathogenesis of alcoholic hepatitis[J].Journal of Gastroenterol and Hepatology,2004,19(S7):S229-S235.

[2]李淑波,鞠文博,王春梅.D-半乳糖肝臟損傷動物模型的建立及其檢測[J].北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,16(5):601-604.

[3]SHAHABADI N,HADIDI S.Molecular modeling and spectrosco-pic studies on the interaction of the chiral drug venlafaxine hydrochloride with bovine serum albumin[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,122:100-106.

[4]CAO S H,JIANG X Y,CHEN J W.Effect of zinc(Ⅱ) on the interactions of bovine serum albumin with flavonols bearing different number of hydroxyl substituent on B-ring[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2010,104(2):146-152.

[5]許金鉤,王尊本.熒光分析法[M].北京:科學(xué)出版社,2006:27-85.

[6]宋玉民,吳錦繡,鄭秀榮，等.稀土金屬離子與人血清白蛋白的相互作用[J].無機化學(xué)學(xué)報,2006,22(9):1615-1622.

[7]LIAO Z X,YU X Y,YAO Q,et al.Interactions between pirenoxine and bovine serum albumin in aqueous solution[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2014,129:314-319.

[8]劉保生,王晶,薛春麗，等.頭孢噻肟鈉和氯霉素與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析[J].發(fā)光學(xué)報,2011,32(6):628-635.

[9]張玉霖,雷迪,陳莉.熒光光譜法研究鹽酸二甲雙胍與牛血清白蛋白的相互作用[J].化學(xué)與生物工程,2015,32(6):46-49.

[10]ROSS P D,SUBRAMAIAN S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3101.

Spectra Analysis of Interaction Between D-Galactose and Bovine Serum Albumin

ZHANG Huai-bin,XU Chang,XING Ru-yue

(SchoolofPharmacy,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China)

TheinteractionbetweenD-galactose(D-Gal)andbovineserumalbumin(BSA)wasinvestigatedbyaspectraanalysis.Resultsindicatedthat,thefluorescencespectrumofBSAwasquenchedwiththeincreasingofD-Galconcentration,andthequenchingprocesswasastaticmechanism.ThemaximumemissionpeakofBSAemergedablueshift.TheultravioletabsorptionspectrumandsynchronousfluorescencespectrumindicatedthatD-GalloosenedtheskeletonofBSAandimprovedthehydrophobicityofBSA.ThethermodynamicanalysisindicatedthatthemainactingforceofinteractionbetweenD-GalandBSAwashydrophobicforce.

D-galactose(D-Gal);bovineserumalbumin(BSA);spectrumanalysis;hydrophobicforce

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.016

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目(2015WS0495)，山東省高等學(xué)?？萍加媱澷Y助項目(J12LD550)，濱州醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(BY2014DKCX092，BY2015DKCX025)

2016-03-22

張懷斌(1978-)，男，山東青州人，講師，研究方向：生物分析化學(xué)，E-mail：zhanghuaibinhua@163.com。

O 657.3

A

1672-5425(2016)08-0067-03

張懷斌，徐暢，邢汝月.D-半乳糖與牛血清白蛋白相互作用的光譜分析[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：67-69.