舒承松，陳瑞華，汝長(zhǎng)海,2

(1.蘇州大學(xué) 江蘇省先進(jìn)機(jī)器人技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué) 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215006)

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基于顯微操作的高效細(xì)胞電融合芯片的設(shè)計(jì)

舒承松1，陳瑞華3，汝長(zhǎng)海1,2

(1.蘇州大學(xué) 江蘇省先進(jìn)機(jī)器人技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué) 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215006)

設(shè)計(jì)了一款基于顯微操作的高效細(xì)胞電融合芯片，并針對(duì)該電融合芯片提出了一種快速、準(zhǔn)確、靈活的細(xì)胞配對(duì)融合操作方法。芯片使用ITO玻璃作為基底，在ITO上覆蓋一層2 μm厚的正光刻膠，并利用光刻加工技術(shù)在光刻膠上加工出直徑25 μm的微孔電極。設(shè)計(jì)了不同電極間距的微孔電極陣列，與鎢針電極構(gòu)成電融合電極對(duì)進(jìn)行了細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，電極間距為10 mm的微孔電極陣列能夠?qū)崿F(xiàn)高效的細(xì)胞配對(duì)，在間距為0.5 mm的微孔電極陣列上未觀測(cè)到細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

顯微操作；配對(duì)方法；電融合芯片；光刻；微孔電極

細(xì)胞電融合是一種發(fā)展迅速的細(xì)胞工程技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于植物雜交[1]、抗腫瘤疫苗制備[2]和單克隆抗體制備[3]等領(lǐng)域。快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)待融合細(xì)胞的配對(duì)一直是細(xì)胞電融合的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞配對(duì)進(jìn)行了大量研究，并利用現(xiàn)代微加工技術(shù)設(shè)計(jì)了很多高效的電融合芯片。

麻省理工研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了雙面凹形的微陷阱陣列，通過(guò)控制融合芯片內(nèi)部的液體流動(dòng)，使體積相近的兩種細(xì)胞準(zhǔn)確快速地配對(duì)[4]，后續(xù)通過(guò)改進(jìn)陷阱的結(jié)構(gòu)使體積相差較大的細(xì)胞也能排隊(duì)融合[5-6]。重慶大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)一直致力于高通量微電極陣列芯片的研究，通過(guò)優(yōu)化電極的形狀與位置，不斷提高細(xì)胞電融合芯片的精度與效率[7-9]。這些芯片主要針對(duì)單克隆抗體或腫瘤疫苗制備等需進(jìn)行大量細(xì)胞配對(duì)的場(chǎng)合；若細(xì)胞數(shù)量較少，易造成細(xì)胞丟失而導(dǎo)致細(xì)胞配對(duì)率低。如牛的體細(xì)胞核移植時(shí)，需將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞電融合。由于兩種細(xì)胞體積相差較大，使用目前的電融合芯片難以準(zhǔn)確配對(duì)。目前常選擇人工操作微電極移動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行配對(duì)，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差。

Clow等[10]針對(duì)這種情況，利用光刻膠覆蓋一對(duì)交錯(cuò)的鈦電極，設(shè)計(jì)了一款獨(dú)特的微孔電極陣列芯片，將以前需人工操作的微電極固定，通過(guò)移液管將細(xì)胞搬運(yùn)到電極附近，再使用介電泳力將細(xì)胞配對(duì)。這款芯片的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，缺點(diǎn)是針對(duì)不同體積的細(xì)胞需要設(shè)計(jì)不同間距的電極，不夠靈活。

相比于一對(duì)固定電極或者一對(duì)移動(dòng)電極，一側(cè)固定電極、一側(cè)移動(dòng)電極的設(shè)計(jì)能夠很好地綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，并且在最大程度上避免兩者的缺點(diǎn)。作者將自制的微孔電極陣列芯片與一根尖端約20μm的鎢針電極構(gòu)成一對(duì)融合電極，進(jìn)行了細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)，并探討了不同間距的微孔電極陣列對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1　細(xì)胞電融合原理

細(xì)胞電融合過(guò)程分為3步：第一步，細(xì)胞配對(duì)，使用物理或者化學(xué)方法使待融合細(xì)胞緊密接觸，并沿電場(chǎng)線方向排列；第二步，細(xì)胞膜可逆性電穿孔，對(duì)待融合細(xì)胞施加高壓電脈沖，使得細(xì)胞接觸部分的細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔；第三步，細(xì)胞膜融合，繼續(xù)保持細(xì)胞間的緊密接觸直到細(xì)胞完成膜融合。細(xì)胞電融合過(guò)程如圖1所示。

細(xì)胞配對(duì)細(xì)胞膜可逆性電穿孔細(xì)胞膜融合

圖1細(xì)胞電融合過(guò)程示意圖

Fig.1Schematic images of cell electrofusion process

由圖1可知，在加入正弦交變電場(chǎng)后，電場(chǎng)中的細(xì)胞被極化形成電偶極子，并在介電泳力的作用下在電極上排隊(duì)(圖1a)；細(xì)胞膜在高壓電脈沖下出現(xiàn)可逆性電穿孔，電解液中溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞使得細(xì)胞膜膨脹(圖1b)；繼續(xù)保持正弦信號(hào)使得細(xì)胞依然緊密接觸直至細(xì)胞完成膜融合(圖1c)。

2　芯片的設(shè)計(jì)與制造方法

實(shí)驗(yàn)所用雜交瘤細(xì)胞直徑在18～25 μm之間，因此將微孔電極直徑設(shè)計(jì)為25 μm。

在最初的電極設(shè)計(jì)中，微孔電極陣列的電極間距為0.5 mm，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用1滴融合液將電極全部覆蓋，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未觀察到微孔電極吸附細(xì)胞的現(xiàn)象，初步推測(cè)可能是多個(gè)電極在融合液滴中產(chǎn)生的電場(chǎng)相互干擾，減小了細(xì)胞受到的介電泳力。

因此，將電極間距改為10 mm，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)微孔電極用1個(gè)微滴單獨(dú)覆蓋，并以0.5 mm間距的電極陣列作為對(duì)照。

圖2為設(shè)計(jì)的掩模板(40 mm×40 mm)。

a.0.5 mm間距的電極陣列　b.10 mm間距的電極陣列　c.用于接出導(dǎo)線，連接融合信號(hào)發(fā)生器　d.無(wú)電極，在實(shí)驗(yàn)時(shí)放置待操作的細(xì)胞

在鍍有氧化銦錫(ITO)薄膜(厚度約180 nm)的玻璃上旋涂一層厚度約為2 μm的正光刻膠RZJ-390PG。在100 ℃前烘90 s后蓋上掩模板曝光5 s；120 ℃后烘120 s后，放入顯影液中60 s。顯影完畢后用去離子水清洗芯片，在顯微鏡下觀察芯片是否加工完成。加工完成的電極芯片如圖3所示。

電極芯片實(shí)物圖0.5 mm間距的電極陣列

圖3電極芯片

Fig.3Electrode chip

3　實(shí)驗(yàn)

3.1材料與儀器

雜交瘤細(xì)胞 pd1-612由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供；電融合緩沖液(溶液成分0.3 mol·L-1甘露醇，0.1 mmol MgCl2，0.1 mmol CaCl2，37 ℃時(shí)電導(dǎo)率為80 μS·cm-1)。

TE2000型倒置顯微鏡，Nikon公司；定位運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，Prior公司；MP285型顯微操作儀，Sutter公司；A601f型CCD攝像機(jī)，Basler公司； PHD ULTRATM4400型微量注射泵，Harvard公司；恒溫?zé)崤_(tái)，TOKAT HIT公司；自制電融合儀。

3.2實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

將自制30 μm內(nèi)徑的玻璃移液管與微量注射泵連接，安裝在左操作手上，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吸吐與搬運(yùn)操作。將鎢絲尖端磨至20 μm，裝在右操作手上并與自制電融合儀相連。自制的電融合芯片放置在定位運(yùn)動(dòng)平臺(tái)上，并與自制電融合儀連接。細(xì)胞電融合顯微操作系統(tǒng)如圖4所示。

在細(xì)胞配對(duì)與電融合實(shí)驗(yàn)中，由于細(xì)胞培養(yǎng)液中離子濃度很高，在外加電場(chǎng)下會(huì)產(chǎn)生明顯的焦耳熱現(xiàn)象，使液體產(chǎn)生對(duì)流影響細(xì)胞排隊(duì)，同時(shí)較高的離子濃度也會(huì)降低溶液中的電場(chǎng)梯度，影響細(xì)胞電穿孔效果。因此實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需將細(xì)胞離心，且用37 ℃的電融合緩沖液替換細(xì)胞培養(yǎng)液。

3.3細(xì)胞配對(duì)實(shí)驗(yàn)

(1)控制平臺(tái)移動(dòng)，在顯微鏡下找到電融合芯片上微孔電極的位置并記錄。

圖4　細(xì)胞電融合顯微操作系統(tǒng)

(2)用移液槍在微孔電極上方滴加不含細(xì)胞的電融合液。用100 μL溶液覆蓋0.5 mm間距電極陣列的整個(gè)區(qū)域；用4滴50 μL的溶液分別覆蓋10 mm間距電極陣列中的4個(gè)微孔電極。

(3)用移液槍吸取適量含有細(xì)胞的電融合液加入到芯片上無(wú)電極區(qū)域。使用左操作手與微量注射泵控制玻璃移液管吸取少量細(xì)胞。

(4)將平臺(tái)移動(dòng)到微孔電極所在區(qū)域，控制右操作手帶動(dòng)鎢針電極靠近微孔電極，并打開(kāi)自制電融合儀，接通細(xì)胞配對(duì)信號(hào)(-2～2 V，1 MHz，正弦波)。

(5)控制左側(cè)玻璃移液管在微孔電極附近吐出一個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞將在重力與介電泳力的作用下吸附在底部微孔電極上。

(6)控制左側(cè)玻璃移液管吐出第二個(gè)細(xì)胞，這次細(xì)胞吐出的位置應(yīng)稍稍偏右，有助于細(xì)胞與上一個(gè)細(xì)胞形成細(xì)胞串。

(7)待細(xì)胞成串排列后，加入細(xì)胞電穿孔信號(hào)，完成電穿孔后，保持細(xì)胞配對(duì)信號(hào)30 s，等待細(xì)胞膜融合。

(8)待細(xì)胞完成膜融合后，移動(dòng)平臺(tái)到另一個(gè)微孔電極處，重復(fù)步驟(4)～(7)。

4　結(jié)果與討論

圖5為電極間距為0.5 mm的電極陣列中細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程。

圖5a中，細(xì)胞位于微孔電極附近，但此時(shí)細(xì)胞并未在介電泳力的作用下向微孔電極移動(dòng)。圖5b中，控制右側(cè)鎢針電極靠近微孔電極后，細(xì)胞在介電泳力的作用下吸附到鎢針電極上。

圖6為電極間距為10 mm的電極陣列中細(xì)胞的配對(duì)過(guò)程。

圖6a中，移液管吐出的細(xì)胞在介電泳力與重力的作用下被微孔電極吸附。圖6b中，移液管吐出的兩個(gè)細(xì)胞成串排列。

細(xì)胞位于微孔電極附近　　　　　細(xì)胞吸附到鎢針電極上

單個(gè)細(xì)胞吸附兩個(gè)細(xì)胞成串配對(duì)

圖6細(xì)胞配對(duì)過(guò)程

Fig.6Cell paring process

結(jié)果表明，采用0.5 mm間距的電極陣列進(jìn)行細(xì)胞配對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于一個(gè)微滴中有多個(gè)電極的存在，導(dǎo)致細(xì)胞受到的介電泳力減弱，細(xì)胞由于細(xì)胞膜粘附力的作用，附著在芯片上，沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)。增大排隊(duì)信號(hào)幅值或減小電極間距后，細(xì)胞向右側(cè)鎢針電極移動(dòng)。

當(dāng)電極間距為10 mm時(shí)，一滴50 μL的微滴僅覆蓋了一個(gè)微孔電極，微滴中的電場(chǎng)分布情況簡(jiǎn)單，可以簡(jiǎn)化成兩根針尖電極對(duì)細(xì)胞進(jìn)行作用。在外加峰峰值為2 V、頻率為1 MHz的正弦排隊(duì)信號(hào)后，微孔邊緣周邊50 μm內(nèi)的腫瘤細(xì)胞能以20 μm·s-1的速度向電極中心移動(dòng)。

5　結(jié)論

所有的細(xì)胞核移植過(guò)程中都需要使待融合的細(xì)胞緊密接觸，并且盡量使細(xì)胞對(duì)的長(zhǎng)軸與電場(chǎng)線方向平行。由操作員手動(dòng)調(diào)整待融合細(xì)胞的位置的方法難度較大，并且容易給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)干擾。

針對(duì)這種需要對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確配對(duì)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了一種新的細(xì)胞電融合芯片，基于該芯片提出了一種細(xì)胞電融合顯微操作方法。細(xì)胞配對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10 mm間距的微孔電極陣列能夠高效地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞排隊(duì)。

該芯片制作簡(jiǎn)單、操作容易、適用于多種直徑的細(xì)胞。與同領(lǐng)域的其它細(xì)胞電融合顯微操作方法相比，本方法對(duì)人工操作精度的要求更低，更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞配對(duì)的自動(dòng)化。

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Design of an Efficient Cell Electrofusion Chip Based on Micromanipulation

SHU Cheng-song1,CHEN Rui-hua3,RU Chang-hai1,2

(1.JiangsuProvincialKeyLaboratoryofAdvancedRobotics,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;2.CollaborativeInnovationCenterofSuzhouNanoScienceandTechnology,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;3.InstituteofClinicalImmunology,TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China)

Anefficientcellelectrofusionchipbasedonmicromanipulationwasdesigned.Afast,accurateandflexiblecellpairingmethodwasdevelopedforthiselectrofusionchip.Thechipprototypewasfabricatedonanindiumtinoxide(ITO)substratethatwassubsequentlycoveredbyapositivephotoresistfilmwiththethicknessof2μm.Microporeelectrodesmeasuring25μmindiameterwerefabricatedonthefilmbylithography.Microporeelectrodearrayswithdifferentspacingsweremanufacturedandpairedwithtungstenneedleforcellelectrofusionexperiment.Resultsshowedthatmicroporeelectrodearraywitha10mmspacingcouldpairthecellefficiently,howevercellsalignonthemicroporeelectrodearraywith0.5mmspacingwasnotobserved.

micromanipulation;pairingmethod;electrofusionchip;lithography;microporeelectrode

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.015

國(guó)家重大科研儀器設(shè)備研制專項(xiàng)(61327811)，國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61174087，61233010)，江蘇省杰出青年基金資助項(xiàng)目(BK2012005)

2016-03-31

舒承松(1990-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：顯微操作系統(tǒng)，E-mail：sudamugong@163.com；通訊作者：汝長(zhǎng)海，教授，E-mail：rzh@suda.edu.cn。

Q 813.2

A

1672-5425(2016)08-0063-04

舒承松，陳瑞華，汝長(zhǎng)海.基于顯微操作的高效細(xì)胞電融合芯片的設(shè)計(jì)[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：63-66.