萬聰，黃亞萍，汪妹，肖亞梅，趙小陽

(1. 教育部蛋白質(zhì)化學(xué)和魚類發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙　410081；2. 發(fā)育生物學(xué)教研室，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州　510515)

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Helq 對(duì)干細(xì)胞多能性影響的研究

萬聰1,2△，黃亞萍1,2△，汪妹1,2，肖亞梅1*，趙小陽2

(1. 教育部蛋白質(zhì)化學(xué)和魚類發(fā)育生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙410081；2. 發(fā)育生物學(xué)教研室，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州510515)

目的探討Helq缺失是否影響干細(xì)胞的多能性。方法利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得Helq敲除的胚胎干細(xì)胞。結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示敲除Helq后，Oct4及Nanog的表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異，通過四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明胚胎干細(xì)胞的多能性不受影響。同時(shí)我們利用Helq敲除的胚胎干細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行體外分化，最終可以得到Day2的上胚層樣細(xì)胞。通過免疫染色及real-timePCR分析，結(jié)果表明Helq敲除的胚胎干細(xì)胞分化為上胚層細(xì)胞液無明顯異常。結(jié)論 Helq缺失不影響多能性干細(xì)胞的多能性。

Helq；多能性；胚胎干細(xì)胞；上胚層樣細(xì)胞；CRISPR-Cas9

Helq是一種ATP依賴的具有3’-5’方向的DNA解旋酶，最早發(fā)現(xiàn)在古細(xì)菌和多細(xì)胞生物中[1]。已有研究表明Helq主要是修復(fù)DNA復(fù)制中所產(chǎn)生的鏈間交錯(cuò)(interstrandcrosslink,ICL)來維持基因組的穩(wěn)定性，其作用途徑與范可尼(Fanconianemia,FA)途徑不一致，主要通過與復(fù)合體Bcdx2結(jié)合來參與修復(fù)[2]。當(dāng)DNA出現(xiàn)ICL時(shí)，Helq就會(huì)在停滯的DNA復(fù)制叉上打開父本鏈，并重新塑造一條新的滯后鏈，以便于招募DNA損傷所需要的底物因子或重新開始DNA復(fù)制[3]。在哺乳動(dòng)物中，Helq主要表達(dá)在睪丸、卵巢、心臟及骨骼肌等地方[4]。當(dāng)該基因發(fā)生突變后，細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C敏感，細(xì)胞內(nèi)染色單體或染色體出現(xiàn)畸變，DNA損傷反應(yīng)性激酶(ATR)底物CHK1的磷酸化合物及G2/M期的細(xì)胞減少[5]。雖然Helq敲除的小鼠出生符合孟德爾遺傳定律，并且能夠正常生長。但是，其敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)生育能力降低及腫瘤發(fā)生的現(xiàn)象。在Helq敲除雌鼠中卵巢癌出現(xiàn)的概率會(huì)增加2倍，在雄性小鼠中，睪丸內(nèi)曲細(xì)精管中會(huì)有10%～20%左右的生殖細(xì)胞的缺失[6]。已有的研究報(bào)道，范可尼病人來源的體細(xì)胞無法通過Yamanaka四因子(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)進(jìn)行重編程，或利用低氧環(huán)境獲得范可尼病人體細(xì)胞來源的iPSC(inducedpluripotentstemcells)無法獲得畸胎瘤，表明DNA的穩(wěn)定性可能影響人類多能性干細(xì)胞的多能性[7,8]。由于Helq通過修復(fù)DNA的鏈間交錯(cuò)來維持基因組的穩(wěn)定性，其缺失是否也影響多能性干細(xì)胞的多能性，目前并不清楚。本文利用基因敲除技術(shù)及體外分化體系，研究Helq對(duì)胚胎干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞向上胚層細(xì)胞分化過程中的影響，為進(jìn)一步論證Helq對(duì)干細(xì)胞多能性的影響提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)的ICR小鼠，雄性5只，雌性10只，6～8周齡，體重19～23g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京)2012-0001】，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)【SYXK(粵)2011-0074】，室溫21～25℃，光照周期12h。自由取食及飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲南方醫(yī)科大學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(L2015071)，并按照委員會(huì)的指南和規(guī)定執(zhí)行。

1.2試劑

1.2.1N2B27培養(yǎng)液

DMEM/F12，Neurobasal，N2-supplement(100X)，B27-Supplement(50X)，Gluta-MAX(2mmol/L)，streptomycin(0.1mg/mL)，β-mercaptoethanol(0.1mmol/L)，2%BSA，insulin(10mg/mL)。

1.2.2ES培養(yǎng)液

N2B27，LIF(1000U/mL)，PD0325901(0.4μm)，CHIR99021(3μmol/L)。

1.2.3細(xì)胞分化培養(yǎng)液

N2B27，1%KSR，bFGF(12ng/mL)，activinA(20ng/mL)。

1.2.4成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液

DMEM，F(xiàn)BS，GlutaMAX(2mmol/L)，streptomycin(0.1mg/mL)，NEAA(0.1mmol/L)。

1.2.5細(xì)胞試劑

0.01%多聚鳥氨酸(PLO)，0.05%及0.25%胰蛋白酶，DMSO，纖粘連蛋白(laminin)，fibronectin，絲裂霉素C，PBS。

1.2.6分子試劑

TRIzol，SYBRGreenReal-timePCRMasterMix-Plus，MicroEluteGenomicDNAKit，Nanog抗體，Oct4 抗體，4%多聚甲醛，2%BSA，Hoechst(H3570)。

1.3方法

1.3.1小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞(Feeder)的建立

頸椎脫臼法處死13.5dpc孕鼠，取出胎兒于PBS中清洗。用鑷子去除羊膜和胎盤后，將胚胎放置新的含有PBS的皿中，去除頭、四肢和內(nèi)臟，留軀干用剪刀剪碎，加入0.25 %胰酶消化10～15min后，加入含10%FBS的DMEM終止，離心。所收獲的細(xì)胞培養(yǎng)在10cm培養(yǎng)皿中。待胚胎成纖維細(xì)胞長滿后加入10μg/mL絲裂霉素C處理2h。吸走上清，用PBS洗3遍，加入0.25% 胰酶消化5min，用含10%FBS的DMEM終止，離心，去上清。用含10%DMSO的90%FBS凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ES)的培養(yǎng)及上胚層樣細(xì)胞(epiblast-likecells,EpiLCs)的分化

將小鼠Feeder鋪于3.5cm皿中，用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。24h后去上清加入ES細(xì)胞培養(yǎng)液，并將小鼠ES細(xì)胞種于feeder上。待ES細(xì)胞在feeder上傳2～3代后，傳至預(yù)鋪有0.01%PLO及l(fā)aminin(10ng/mL)基質(zhì)的3.5cm皿中。傳3代后，消化ES細(xì)胞，將基質(zhì)換成fibronectin(16.7μg/mL)，培養(yǎng)液換成分化培養(yǎng)液，并以2×105/ 3.5cm皿的密度進(jìn)行培養(yǎng)，分化36～48h。

1.3.3RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

收取分化第2天的(Day2)EpiLCs用TRIzol提取RNA。 取1μgRNA并以O(shè)lig-dT為引物反轉(zhuǎn)成cDNA。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

以合成的cDNA為模板，使用SYBRGREENPCRMasterMix試劑盒，對(duì)EpiLCs多能性基因、上胚層、原始內(nèi)胚層及內(nèi)胚層基因進(jìn)行表達(dá)分析。每次定量分析設(shè)三個(gè)重復(fù)樣品?；蛞锶绫?。

1.3.5免疫熒光染色

在鋪有圓形玻璃片的四孔板中接種feeder，次日將ES細(xì)胞傳于feeder中，培養(yǎng)2～3d。同樣將無feeder上的ES細(xì)胞消化后，換成分化培養(yǎng)液，接種于鋪有基質(zhì)及圓形玻璃片的四孔板中分化40h。將上述四孔板中的細(xì)胞用PBS洗2遍，加入500μL的4%多聚甲醛室溫固定30min。PBS洗脫，2%BSA封閉1h。4℃，孵育一抗，過夜。次日用PBS洗三遍后室溫避光孵育二抗1h。PBS洗三遍，加入200μL的10μmol/LHoechst(H3570)，20min，吸走多余液體，用抗熒光淬滅劑封片。

1.3.6基因組的提取及鑒定

細(xì)胞基因組利用MicroEluteGenomicDNAKit試劑盒提取，送至華大基因測序。

表1　Real-time PCR 引物序列

注：A. Helq的基因位點(diǎn)(黃色區(qū)域代表外顯子)；B. Helq-/-的測序結(jié)果。圖1　建立Helq基因敲除胚胎干細(xì)胞系Note. A. Gene locus of Helq (the yellow area represents the exon). B. The sequencing result of Helq-/- in embryonic stem cells.Fig.1　Generation of Helq-/- embryonic stem cells

2　結(jié)果

2.1建立小鼠Helq敲除(Helq-/-)胚胎干細(xì)胞系

通過NCBI網(wǎng)站查找小鼠的Helq基因的序列，在Helq基因的Exon1(翻譯起始密碼子ATG之后)上設(shè)計(jì)sgRNA(見圖1A)。將構(gòu)建好的px330-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到小鼠的ES細(xì)胞中，挑取10個(gè)單克隆細(xì)胞于4孔板中，利用T7EI實(shí)驗(yàn)和Sanger測序鑒定單克隆基因型，得到一個(gè)純合敲除的單克隆，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)等位基因分別缺失2bp和8bp堿基,導(dǎo)致閱讀框的堿基序列發(fā)生移碼突變使HELQ蛋白完全被破壞(見圖1B)。該克隆通過擴(kuò)增后建立成穩(wěn)定的干細(xì)胞系。

2.2小鼠ES細(xì)胞多能性的鑒定

將WT(wildtype)及Helq-/-的ES細(xì)胞系從feeder狀態(tài)下傳至鋪有基質(zhì)的皿里。在無feeder狀態(tài)下傳3代。我們選取了重要的多能性基因Oct4和Nanog，通過免疫熒光染色可知，Helq-/-和WT相比，兩者多能性狀態(tài)并無出現(xiàn)明顯差異(圖2A)，說明在ES細(xì)胞培養(yǎng)階段，Helq突變不影響Oct4和Nanog的表達(dá)。進(jìn)一步通過將WT和Helq-/-注射到四倍體囊胚中，可以得到存活的個(gè)體，表明Helq-/-ES細(xì)胞具有發(fā)育為整個(gè)動(dòng)物個(gè)體的能力(圖2B)，以上實(shí)驗(yàn)表明Helq對(duì)ES細(xì)胞多能性狀態(tài)無影響。

注：A. 小鼠ES細(xì)胞免疫染色熒光圖，從左至右依次為白光圖Oct4、Nanog、及Hoechst；scale bar=100 μm。B. 新生四倍體補(bǔ)償小鼠；Scale bar=2 mm。圖2　小鼠ES細(xì)胞多能性的檢測 Note. A. Shows the immunostaining of embryonic stem cells. From left to right: Bright-field, Oct4-green, Nanog-red, Hoechst-blue. Scale bar=100 μm; B. 0.5 dpc “all-ES” mouse by tetraploid complementation. Scale bar=2 mm。Fig.2　Pluripotency of Helq-/- embryonic stem cells

2.3ES細(xì)胞向EpiLCs的定向分化及鑒定

為了進(jìn)一步研究胚胎干細(xì)胞分化為上胚層細(xì)胞過程中是否存在異常，我們繼續(xù)將ES細(xì)胞在體外進(jìn)行定向分化成EpiLCs。如圖3A所示，Day2EpiLCs的細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞與細(xì)胞之間致密，死細(xì)胞較少，形態(tài)上與WT組沒有明顯區(qū)別。免疫熒光染色鑒定可知，Oct4與Nanog兩個(gè)多能性基因的表達(dá)在兩組中差異不大(圖3B)。Real-timePCR分析多能性O(shè)ct4、Sox2、Nanog，內(nèi)胚層(ICM)特異基因(Zfp42、Esrrb)，上胚層基因(Wnt3、Dnmt3b)以及原始內(nèi)胚層基因(Gata4、Gata6)的表達(dá)可以看出，敲除Helq后，與WT相比，各基因之間表達(dá)差異不明顯(圖3C)。以上結(jié)果說明Helq對(duì)ES細(xì)胞體外分化形成EpiLCs基本無影響。

注：A. Day2 EpiLCs白光圖片，scale bar=100 μm； B. 免疫熒光染色圖，從左至右分別為Hoechst、Oct4及Nanog，scale bar=100 μm；C. 多能性O(shè)ct4、Sox2、Nanog，內(nèi)胚層Zfp42、Esrrb，上胚層基因Wnt3、Dnmt3b以及原始內(nèi)胚層Gata4、Gata6 的Real-time PCR結(jié)果。圖3　Day2 EpiLCs多能性檢測 Note. A. Bright-field of day2 EpiLCs. Scale bar=50 μm. B. Immunostaining analysis of expression of Oct4 (middle) and Nanog (right) of day2 EpiLCs, DNA labeled by Hoechst (left). Scale bar=50 μm. C. Real time PCR analysis of EpiLCs, from left to right, Oct4/Sox2/Nanog; ICM genes Zfp42/Esrrb; epiblast genes Wnt3/Dnmt3b; primitive endoderm genes Gata4/Gata6.Fig.3　Gene expression of the Day2 epiblast-like cells

3　討論

在本研究中利用CRISPR-Cas9建立了Helq-/-的ES細(xì)胞系，并通過免疫染色及四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)證明Helq-/-不影響ES細(xì)胞的多能性。我們將Helq-/-的ES細(xì)胞系繼續(xù)進(jìn)行體外定向分化，得到Day2的EpiLCs，并且對(duì)Day2EpiLCs進(jìn)行免疫染色及基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示，Helq-/-與WT組相比，EpiLCs的基因表達(dá)無明顯差異。從而表明Helq不影響干細(xì)胞的多能性。

根據(jù)之前文獻(xiàn)報(bào)道，采用TELEN及ZFNs的方法，在Helq的1號(hào)外顯子或11號(hào)外顯子敲除或插入的方式均能使Helq基因表達(dá)提前終止[9,10]。我們利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在Helq的基因組的1號(hào)外顯子上一條鏈上敲除2個(gè)堿基，另一條鏈上敲除8個(gè)堿基，使閱讀框的堿基序列發(fā)生移碼突變，使得HELQ蛋白完全被破壞而成功得到Helq純合敲除的胚胎干細(xì)胞系。與之前所用的TALEN與ZFNs相比，CRISPR針對(duì)每個(gè)基因，只需要構(gòu)建一個(gè)sgRNA，效率較高，序列選擇限制較小。利用CRISPR-Cas9能更加快速的獲得基因敲除細(xì)胞系。

在DNA復(fù)制過程中發(fā)生損傷，若不進(jìn)行修復(fù)，則會(huì)導(dǎo)致多種疾病。常見的修復(fù)途徑主要是FA信號(hào)通路[11]。有研究表明，用FA病人的細(xì)胞進(jìn)行重編程時(shí)，影響誘導(dǎo)形成iPSC的效率[12]。Chd1l作為另一種DNA解旋酶，該基因發(fā)生突變后，使其不能夠結(jié)合到Pou5f1, Nanog, 及 Esrrb等基因的位點(diǎn)上，從而影響細(xì)胞的多能性[13]。本研究中通過對(duì)Helq-/-ES細(xì)胞進(jìn)行多能性分析，結(jié)果表明Helq不影響ES細(xì)胞的多能性，其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

已有研究報(bào)道，Helq影響生殖細(xì)胞的發(fā)育。當(dāng)該基因發(fā)生突變后，導(dǎo)致男性出現(xiàn)少精的癥狀，而在女性當(dāng)中則由于發(fā)生卵巢癌而導(dǎo)致不孕[6]。由此可知Helq對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育具有重要的作用。2011年Saitou等[14]能夠通過干細(xì)胞體外分化獲得原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(Primordialgermcell-likecells,PGCLCs)。我們的研究結(jié)果得出Helq敲除的小鼠胚胎干細(xì)胞可以分化得到上胚層樣細(xì)胞，不影響ES細(xì)胞向EpiLCs的分化，為后續(xù)研究Helq在PGCLC分化中的作用奠定了基礎(chǔ)，也對(duì)未來研究Helq對(duì)人類不孕不育的影響提供借鑒。

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Exploration of the effect of Helq gene on stem cell pluripotency

WANCong1,2△,HUANGYa-ping1,2△,WANGMei1,2,XIAOYa-mei1*,ZHAOXiao-yang2

(1.KeyLabofProteinChemistryandDevelopmentalBiologyofMinistryofEducation,CollegeofLifeSciences,HunanNormalUniversity,Changsha410081,China; 2.DepartmentofDevelopmentalBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515)

ObjectiveToexplorewhetherHelqdeletionaffectthepluripotencyofstemcells.MethodsHelqknockoutembryonicstemcellswereobtainedbyCRISPR-Cas9geneeditingtechnique.ResultsTheresultsofimmunofluorescenceanalysisshowedthattheexpressionofOct4andNanoghadnoobviousdifferencetothatofthecontrolcells.TheHelq-/-embryonicstemcellscouldproduceviablepupsbytetraploidcomplementation,indicatingthattheirpluripotencywasnotaffected.Meanwhile,wefoundthatday2epiblast-likecellsalsowereobtainedthroughdifferentiationoftheHelq-/-embryonicstemcellsin vitro.Immunostainingandreal-timePCRanalysisshowedthatthegeneexpressionofHelq-/-epiblastcellsweresimilartothewildtypecells.ConclusionsTakentogether,itisprovedthatthegenomicinstabilitycausedbyHelqdeletiondoesnotaffectthepluripotencyofpluripotentstemcells.

Helq;Pluripotency;Embryonicstemcells;Epiblast-likecells;CRISPR-Cas9

XIAOYa-mei.E-mail:yameix@126.com

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31322036)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：CX2014B228)。

萬聰(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)。Email:congw900822@163.com。△黃亞萍為并列第一作者。

肖亞梅(1968-)，女，教授，研究方向：動(dòng)物生殖發(fā)育及分子調(diào)控機(jī)制。Email:yameix@126.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0358-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.005

2016-01-13