劉華，劉月美，關(guān)芮，徐昭，朱文增

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京　100032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京　100029；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京　100875；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院東區(qū)，北京　101121)

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頸總動(dòng)脈穿刺法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型

劉華1，2，劉月美3，關(guān)芮1，2，徐昭4，朱文增1

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京100032；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京100029；3.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100875；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院東區(qū)，北京101121)

目的對(duì)頸總動(dòng)脈穿刺法及傳統(tǒng)線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型的時(shí)效性、成功率、死亡率比較。方法將32只雄性大鼠隨機(jī)分為頸總動(dòng)脈穿刺法組與傳統(tǒng)線(xiàn)栓法組，將線(xiàn)栓從頸總動(dòng)脈插入，栓塞大腦中動(dòng)脈。采用Bederson神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于術(shù)后24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，并統(tǒng)計(jì)24h成功率及死亡率。結(jié)果頸總動(dòng)脈穿刺法和傳統(tǒng)手術(shù)方法制備大鼠MCAO模型的插線(xiàn)栓時(shí)間、成功率、死亡率分別為(82.3±17.4)s和(164.6 ±22.0)s，差異有顯著性(P<0.01)； 87.5%和68.75%，差異無(wú)顯著性(P>0.05)； 6.25%和18.75%，差異無(wú)顯著性(P >0.05)。結(jié)論頸總動(dòng)脈穿刺法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型簡(jiǎn)單省時(shí)，創(chuàng)傷小，可操作性強(qiáng)。

腦缺血；大腦中動(dòng)脈栓塞；線(xiàn)栓法；大鼠

大鼠顱內(nèi)血管結(jié)構(gòu)與人類(lèi)接近，實(shí)驗(yàn)條件容易標(biāo)準(zhǔn)化，價(jià)格較低，飼養(yǎng)方便，是目前腦缺血研究常用的動(dòng)物。因雌激素能降低大鼠腦梗塞的發(fā)生率和死亡率[1]，對(duì)大鼠腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[2]，擴(kuò)張血管、增加腦血流量[3]，減輕腦損傷[4]，具有明顯的腦保護(hù)作用[5]，故選擇雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。制備MCAO模型方法有線(xiàn)栓法[6]、開(kāi)顱電凝法[7]、血栓栓塞法[8]、光化學(xué)誘導(dǎo)法[9]、顱腦開(kāi)窗法[10]等多種，線(xiàn)栓法制備MCAO模型具有不開(kāi)顱、手術(shù)時(shí)間短、損傷小、穩(wěn)定性和可行性高等特點(diǎn)，且可控制缺血與再灌注的時(shí)間，是國(guó)內(nèi)外常用的方法[11]。1986年Koizumi[6]首先報(bào)道了利用線(xiàn)栓法制備MCAO/R模型，隨后ZeaLonga[12]于1989年在此方法上進(jìn)行改進(jìn)，成為了現(xiàn)今較為廣泛應(yīng)用的方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)2種不同手術(shù)方法的比較分析，成功的使用了穿刺法制作了大鼠MCAO模型?，F(xiàn)將制作該模型的方法及經(jīng)驗(yàn)介紹如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性成年SD大鼠32只，周齡7～8周，體重250～280g，來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)及手術(shù)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)屏障環(huán)境[SYXK(京)2010-0020]。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為頸總動(dòng)脈穿刺法組A(16只)與傳統(tǒng)線(xiàn)栓法組B(16只)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)器材

2636-4A號(hào)線(xiàn)栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司提供)，6號(hào)注射器針頭，自制鼠板，自制拉鉤。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供)、碘伏、75%乙醇。

1.4手術(shù)方法

術(shù)前大鼠禁食不禁水24h[13]，手術(shù)當(dāng)日用生理鹽水現(xiàn)配10%水合氯醛，大鼠稱(chēng)重后按0.35mg/100g腹腔注射麻醉，待其完全麻醉后仰臥位將四肢及頭部固定于鼠板，充分暴露下頜角至胸骨之間的頸部區(qū)域，備皮，分別應(yīng)用不同的手術(shù)方法制備MCAO模型。A組手術(shù)方法：用碘伏將頸部正中線(xiàn)及周?chē)竞笥?5%乙醇脫碘兩次，用11號(hào)手術(shù)刀沿頸部正中線(xiàn)切開(kāi)長(zhǎng)約1.5cm的切口。用彎頭眼科鑷鈍性分離皮下組織、腺體，鈍性分離頸部肌肉，用自制拉鉤將右側(cè)胸骨舌骨肌、胸鎖乳突肌拉向右側(cè)，充分暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈鞘。使用玻璃分針?lè)蛛x右側(cè)頸總動(dòng)脈鞘及迷走神經(jīng)，游離出CCA。調(diào)整自制拉鉤的位置，使右側(cè)頸部的肌肉拉向右上方，充分暴露CCA遠(yuǎn)心端，繼續(xù)使用玻璃分針向遠(yuǎn)心端方向分離CCA直至頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)與頸外動(dòng)脈(ECA)分叉處。使用4-0手術(shù)縫合線(xiàn)結(jié)扎右側(cè)CCA及ECA近心端，并預(yù)留一段牽引線(xiàn)。在CCA遠(yuǎn)心端靠近ICA與ECA分叉處套一個(gè)活結(jié)備用，用血管夾暫時(shí)夾閉ICA以阻斷血流。右手拇指、中指持預(yù)先放入栓線(xiàn)并消毒的6號(hào)注射器針頭，左手持CCA近心端的牽引線(xiàn)并輕微向近心端方向牽拉，以CCA繃直為度。將針尖斜切面朝上向CCA遠(yuǎn)心端方向刺入。針尖斜切面完全進(jìn)入CCA后，用右手食指向CCA內(nèi)推動(dòng)線(xiàn)栓，通過(guò)分叉處的活結(jié)，直至血管夾處。左手松開(kāi)CCA近心端的牽引線(xiàn)并持眼科鑷夾住線(xiàn)栓及血管，右手輕輕向后退出針頭。收緊CCA遠(yuǎn)心端的活結(jié)但不扎死，松開(kāi)血管夾，慢慢將線(xiàn)栓推入ICA，線(xiàn)栓進(jìn)入分叉處(18±1)mm[14]，線(xiàn)栓頭部傳來(lái)輕微的抵抗感，即說(shuō)明線(xiàn)栓頭部進(jìn)入大腦中動(dòng)脈(MCA)，阻斷血流。扎死CCA遠(yuǎn)心端的活結(jié)，剪去多余的線(xiàn)栓尾部、線(xiàn)頭，也可保留線(xiàn)栓尾部于體外，待一定時(shí)間后向后拉出一段線(xiàn)栓造成再灌注模型。松開(kāi)拉鉤，生理鹽水沖洗手術(shù)區(qū)域后用3-0縫合線(xiàn)以單純連續(xù)縫合法縫合切口，酒精消毒，手術(shù)完成。將大鼠以頭高腳低位仰臥放置于鼠籠中，待其清醒。B組手術(shù)方法：參照Z(yǔ)eaLonga[12]的方法并稍加改變，手術(shù)過(guò)程如下：分離結(jié)扎血管步驟同上，用眼科剪在CCA上剪一斜形開(kāi)口并插入線(xiàn)栓，余步驟與A組手術(shù)方法相同。

1.5神經(jīng)功能評(píng)分

參照Bederson神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15]，0分無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分不能完全伸展左前肢(提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)；2分左肩部側(cè)推抵抗力下降(側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性)，伴左前肢屈曲；3分左肩部側(cè)推抵抗力下降，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)(自由活動(dòng)時(shí)向左側(cè)劃圈)；4分不能自發(fā)行走，伴有意識(shí)喪失。

1.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

兩組插線(xiàn)栓時(shí)間、成功率、存活率比較：動(dòng)物術(shù)后24h內(nèi)存活，且神經(jīng)功能評(píng)分1分以上為手術(shù)成功。A、B兩組平均插線(xiàn)栓時(shí)間分別為(82.3±17.4)s、(164.6±22.0)s，差異有顯著性(P<0.01)。表1為兩組手術(shù)成功率和死亡率的情況。結(jié)果表明，A組成功率高于B組，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；A組死亡率低于B組，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

表1　兩組手術(shù)成功率和死亡率比較(n =16)

3　討論

3.1器材

采用自制拉鉤及鼠板，比市售商品廉價(jià)實(shí)用，且可以在充分暴露術(shù)野的前提下盡量減小傷口，對(duì)大鼠刺激減小，節(jié)約手術(shù)時(shí)間，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。

3.2麻醉

水合氯醛溶液不穩(wěn)定，久置、光照、高溫均可促進(jìn)其分解，需現(xiàn)配現(xiàn)用，否則易引起大鼠死亡；術(shù)前禁食不禁水24h，否則食物影響體重易導(dǎo)致水合氯醛給藥不精確造成死亡；腹腔注射時(shí)針頭進(jìn)入大鼠腹腔后需注意將針頭退出些許，防止麻醉藥注射入腸腔造成麻醉不足及術(shù)后腸梗阻。

3.3吸痰

水合氯醛麻醉會(huì)造成呼吸道分泌物增多，易導(dǎo)致大鼠窒息而死，固定大鼠后將大鼠舌頭拉向一側(cè)，術(shù)中需隨時(shí)關(guān)注大鼠呼吸狀態(tài)，呼吸道分泌物增多時(shí)可用注射器吸痰。

3.4備皮

盡量備皮干凈且不傷到皮膚，嚴(yán)格執(zhí)行外科手術(shù)消毒標(biāo)準(zhǔn)，降低術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)。

3.5分離

分離頸動(dòng)脈鞘及迷走神經(jīng)時(shí)盡量采用玻璃分針，減少對(duì)迷走神經(jīng)的刺激。

3.6結(jié)扎

結(jié)扎血管、動(dòng)脈夾夾閉ICA時(shí)需遠(yuǎn)離頸動(dòng)脈竇及迷走神經(jīng)節(jié)，防止大鼠猝死，且建議都結(jié)扎準(zhǔn)備完畢最后再用血管夾夾閉ICA，減少金屬刺激血管及迷走神經(jīng)節(jié)的時(shí)間。結(jié)扎完血管后線(xiàn)頭保留適當(dāng)長(zhǎng)度，當(dāng)線(xiàn)栓進(jìn)入血管后在入顱部分難以推進(jìn)時(shí)，可以充當(dāng)牽引線(xiàn)，適當(dāng)調(diào)整血管及線(xiàn)栓角度，可提高成功率。

3.7線(xiàn)栓

根據(jù)大鼠的體重選擇合適的線(xiàn)栓。最初線(xiàn)栓多是實(shí)驗(yàn)人員以魚(yú)線(xiàn)為原材料自己手工燒制而成，線(xiàn)栓品質(zhì)不穩(wěn)定，現(xiàn)在多采購(gòu)機(jī)械化生產(chǎn)的成品線(xiàn)栓，保證線(xiàn)栓的穩(wěn)定性；朱繼[16]等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將線(xiàn)栓預(yù)設(shè)為弧形，與ICA走行一致，通過(guò)調(diào)整推送線(xiàn)栓角度而不會(huì)進(jìn)入翼腭動(dòng)脈(PPA)，避免對(duì)PPA的結(jié)扎操作，減小刺激，提高成功率。課題組通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)栓凹面向內(nèi)向上彎曲時(shí)更易進(jìn)入ICA。

3.8手法

穿刺時(shí)盡量將針頭與CCA保持平行，以免刺穿血管，且穿刺孔盡量靠近CCA近心端，以防一次穿刺不成功后找不到針眼，可以繼續(xù)向遠(yuǎn)心端尋找穿刺點(diǎn)。如若多次調(diào)整血管及線(xiàn)栓角度仍未成功，建議退出線(xiàn)栓并用血管夾夾閉ICA，更換不同弧度的線(xiàn)栓再次嘗試插入，可大大提高成功率。切不可蠻力硬插入線(xiàn)栓，否則易導(dǎo)致腦出血。退出針頭前需用眼科鑷夾住固定線(xiàn)栓及血管，防止在退出針頭時(shí)將線(xiàn)栓也一并退出血管。

3.9深度

線(xiàn)栓插入約16mm時(shí)應(yīng)當(dāng)放開(kāi)牽引線(xiàn)，放松血管至正常生理形態(tài)，然后緩慢推進(jìn)線(xiàn)栓，至手下有輕微抵抗感即可，此時(shí)插入深度約(18±1)mm[14]。若牽拉血管會(huì)導(dǎo)致血管正常形態(tài)改變，線(xiàn)栓插入成功后放松血管會(huì)導(dǎo)致其位置改變，影響梗塞效果。

3.10其他方法

本課題組成員在實(shí)驗(yàn)初期嘗試不分離頸動(dòng)脈鞘及迷走神經(jīng)直接結(jié)扎血管插入線(xiàn)栓，以期減小對(duì)血管及神經(jīng)的刺激，同時(shí)縮短手術(shù)時(shí)間。但通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一次插入線(xiàn)栓不成功時(shí)，血管塌陷，很難區(qū)分頸動(dòng)脈鞘及血管，難以再次插入線(xiàn)栓；且插入后因頸動(dòng)脈鞘遮擋，難以看清線(xiàn)栓上的標(biāo)記，難以準(zhǔn)確掌握線(xiàn)栓插入的深度，失敗率較高，故未采用。亦嘗試過(guò)按照備皮、分離、插線(xiàn)栓、縫合四個(gè)步驟多人員流水作業(yè)方法，每個(gè)成員負(fù)責(zé)自己最擅長(zhǎng)的部分，大大節(jié)省造模時(shí)間。但是當(dāng)大批量造模時(shí)，人和機(jī)器不同，疲倦現(xiàn)象嚴(yán)重，不利于長(zhǎng)時(shí)間造模手術(shù)的進(jìn)行。

3.11B組劣勢(shì)

采用B組手術(shù)插線(xiàn)栓方法時(shí)，模型成功率較低，且死亡率較高。本課題組成員討論后認(rèn)為可能原因如下：(1)用眼科剪剪開(kāi)的斜形開(kāi)口，在插入線(xiàn)栓時(shí)開(kāi)口部分容易被拽斷，改變了血管原有的生理形態(tài)，所以難以將線(xiàn)栓送入顱內(nèi)。(2)即使勉強(qiáng)將線(xiàn)栓送入顱內(nèi)，也因血管斷開(kāi)，其生理形態(tài)改變而不確定線(xiàn)栓插入的深度，故模型的穩(wěn)定性及成功率較低。(3)手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，且反復(fù)推送線(xiàn)栓不得進(jìn)入，對(duì)血管壁有刺激，術(shù)中出血量增多，易引起大鼠死亡。(4)反復(fù)推送線(xiàn)栓易導(dǎo)致血管壁被刺穿，造成腦出血。

3.12不足與展望

本方法滿(mǎn)足再灌注的需求，但因后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要永久性腦梗塞模型，故未做再灌注模型的成功率及存活率的統(tǒng)計(jì)。其次，因樣本量小，可能對(duì)數(shù)據(jù)會(huì)有誤差，對(duì)手術(shù)成功率及存活率的意義，有待進(jìn)一步大數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)分析。最后，因后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠治療，故未計(jì)算梗死體積變異系數(shù)，模型穩(wěn)定性未知，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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A modified method for common carotid artery puncture in theestablishmentofaratmodelofmiddlecerebralarteryocclusion

LIUHua1，2,LIUYue-mei3,GUANRui1,2,XUZhao4,ZHUWen-zeng1

(1.Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100032,China;2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029; 3.BeijingNormalUniversity,Beijing100875;4.DongzhimenHospitalEasternDistrict,AffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing101121)

ObjectiveTocomparethetimeliness,successandmortalityratesbetweenthemodifiedcarotidarterypuncturemethod(MCAPM)andstandardsuturemethod(SSM)intheestablishmentofratmodelofamiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).MethodsThirty-twomaleratswererandomlyandequallyassignedintoMCAPMgroupandSSMgroup.TheMCAOmodelswereestablishedbyinsertingathreadintothecommoncarotidartery(CCA). 24haftermodeling,theratsofthetwogroupswereevaluatedwithBedersonneurologicalscores,andthemodelingsuccessrateandmortalityratewereanalyzed.ResultsThesutureinsertiontimes,successratesandmortalityratesoftheMCAPMvs.SSMgroupswere(82.3±17.4)sversus(164.6 ±22.0)s(P<0.01), 87.5%versus68.75% (P>0.05),and6.25%versus18.75% (P>0.05).ConclusionsMCAPMcanbeusedtoestablishtheratmodelofMCAOduetoitssimplicity,mildwoundandfeasibility.

Cerebralischemia;Middlecerebralarteryocclusion,MCAO;Standardsuturemethod;Rat

ZHUWen-zen.E-mail:zhuwenzeng530@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273841)。

劉華(1991年-)，男，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail：liuhua@bucm.edu.cn

朱文增，博士后，主任醫(yī)師。E-mail：zhuwenzeng530@163.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0399-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.012

2016-01-19