孔慶輝，晁燕，夏明哲，祁得林*

(1. 青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，西寧　810016；2. 青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧　810016)

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黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因RNA干擾研究

孔慶輝1，晁燕1，夏明哲2，祁得林1*

(1. 青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，西寧810016；2. 青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧810016)

目的 利用反義寡合甘酸技術(shù)抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN)的表達(dá)，評(píng)估MSTN基因的沉默效果，并檢測(cè)RNA干擾后對(duì)下游基因的影響。方法 通過(guò)構(gòu)建黃河裸裂尻魚(yú)(Schizopygopsispylzovi)MSTN基因RNA干擾(RNAi)重組腺病毒載體1P3(DSP MSTN 273+250+1737)和1P2(DSP MSTN 195+1670)，并將其注射黃河裸裂尻魚(yú)肌肉組織，進(jìn)行活體RNA干擾；利用real-time PCR和Western blotting評(píng)估MSTN基因的沉默效果，并檢測(cè)MSTN基因RNA干擾后肌肉肌酸激酶(muscle-type creatine kinase, M-CK)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用。結(jié)果real-time PCR分析結(jié)果表明，與HK組(病毒通用陰性對(duì)照組)和N組(空白對(duì)照組)相比，重組腺病毒載體1P3對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)肌肉MSTN基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的干擾作用(P<0.05)，抑制率達(dá)53.5%；而重組腺病毒載體1P2對(duì)MSTN基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯干擾作用(P>0.05)。Western-blotting分析結(jié)果與real-time PCR結(jié)果相一致。同時(shí)，經(jīng)1P3干擾后隨著MSTN基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，其肌肉肌酸激酶M-CK基因表達(dá)水平顯著上升。結(jié)論 通過(guò)RNAi技術(shù)能夠有效的抑制MSTN基因的表達(dá)，并能夠上調(diào)M-CK基因的表達(dá)量。因此，證明了在黃河裸裂尻魚(yú)中MSTN能夠抑制M-CK的轉(zhuǎn)錄。揭示高原土著魚(yú)類(lèi)MSTN基因的對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育起到調(diào)控作用。

黃河裸裂尻魚(yú)；RNA干擾；肌肉生長(zhǎng)抑制；肌酸激酶；表達(dá)

黃河裸裂尻魚(yú)(Schizopygopsispylzovi)隸屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚(yú)亞科(Schizothoracinae)，在青藏高原東北部黃河干支流和湖泊以及柴達(dá)木水系中廣泛分布[1]，同其他裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)一樣，黃河裸裂尻魚(yú)具有性成熟遲、繁殖力低、生長(zhǎng)期短、生長(zhǎng)緩慢的典型生物學(xué)特性。加之受人類(lèi)干擾和環(huán)境惡化的影響，導(dǎo)致黃河裸裂尻魚(yú)種群數(shù)量一再減少，棲息地日益片斷化[2]。魚(yú)類(lèi)肌肉組織是魚(yú)類(lèi)的組織結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)器官，也是為人類(lèi)提供食物的重要蛋白源。以魚(yú)類(lèi)為重要養(yǎng)殖對(duì)象的水產(chǎn)養(yǎng)殖和自然環(huán)境的保護(hù)，實(shí)質(zhì)上就是按照實(shí)際的生態(tài)環(huán)境和條件，利用合適的技術(shù)，最大限度的加快肌肉纖維細(xì)胞的快速增殖，從而促使肌肉快速生長(zhǎng)發(fā)育。所以，魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中肌肉的分化、生長(zhǎng)是重要的環(huán)節(jié)，受許多環(huán)境、激素和分子水平等因素的調(diào)控。在分子水平上，除了通過(guò)與肌肉分化和生成有關(guān)的正向調(diào)控的生肌決定因子外[3]，肌肉的生長(zhǎng)還受到一些負(fù)調(diào)控因子，特別是肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin, MSTN)的影響[4]。

肌肉生長(zhǎng)抑制素，又稱(chēng)GDF-8(growth differentiation factor 8)，是1997年由Mcpherron等[4]發(fā)現(xiàn)在骨骼肌的發(fā)育和生長(zhǎng)中特異性表達(dá)且功能比較專(zhuān)一的肌肉負(fù)調(diào)控因子，屬于轉(zhuǎn)化因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)超家族中的一員。MSTN同TGF-β超家族的其他成員一樣，在近N-末端的前肽序列具有疏水性，是分泌用信號(hào)肽序列；N-末端和C-末端之間的蛋白酶水解加工位點(diǎn)(RXXR)以及C-末端的成熟肽活性區(qū)。成熟肽在被切割后可負(fù)向調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，MSTN前肽在骨骼肌中可與MSTN成熟肽結(jié)合，抑制MSTN成熟肽的活性，促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)。有研究表明，MSTN基因過(guò)度表達(dá)，將通過(guò)下調(diào)肌肉肌酸激酶(muscle-type creatine kinase, M-CK)的活性，可逆的抑制生肌的過(guò)程。同時(shí)，降低MSTN的表達(dá)水平，可以提高M(jìn)-CK的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)生肌過(guò)程[5]。肌酸激酶(creatine kinase, CK)能夠催化二磷酸腺苷ADP和磷酸肌酸之間磷酸基的可逆轉(zhuǎn)移[6]，是一個(gè)存在于動(dòng)物的腦組織、心臟及骨骼肌的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的重要激酶，與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、肌肉收縮密切相關(guān)[7,8]。2014年王景圓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肌肉細(xì)胞中Rheb基因上調(diào)可以引起MSTN表達(dá)量的上調(diào)，M-CK有不同程度的下降。肌肉中MSTN基因的變化能夠引起M-CK不同程度的變化。所以，肌肉肌酸激酶不僅參與能量代謝過(guò)程，還與個(gè)體發(fā)育過(guò)程中肌肉的生長(zhǎng)有密切聯(lián)系[5,10,11]。

國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者將目光投向了RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)。從20 世紀(jì)90年代，Carolyn研究組發(fā)現(xiàn)矮牽?；ɑò甑纳钭仙臎Q定因素是花青素[12]，到1995 Guo 等[13]從線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn) RNA 干擾現(xiàn)象。RNA干擾都是研究功能基因的有力工具。1997年首次在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了該基因， 通過(guò)基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)敲除MSTN基因的小鼠骨骼肌重量大幅度增加。對(duì)MSTN基因敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)， 脂肪沉積能力隨著年齡的增加而降低[4]。通過(guò)對(duì)小鼠[14,15]、魚(yú)類(lèi)[16,17]、雞[18,19]、豬[20]和牛[21]的MSTN基因及其多克隆的抗體的研究表明，利用肌肉生長(zhǎng)抑制素的拮抗物可以有效的阻斷肌肉生長(zhǎng)抑制素的分子通路，并且能夠有效地促進(jìn)動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育。本研究以黃河裸裂尻魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)前期獲得的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因序列設(shè)計(jì)引物、構(gòu)建獲得反義寡核苷酸序列。利用反義寡合甘酸技術(shù)抑制MSTN基因表達(dá)，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，為突破高原冷水魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)緩慢的瓶頸、推動(dòng)土著魚(yú)類(lèi)的保護(hù)利用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集

黃河裸裂尻魚(yú)共24尾，雌性各半，體重為25.01～15.33 g。采集于青海省大通縣湟水河支流—寶庫(kù)河(37o14′24.72′′N(xiāo), 101o28′36.12′′E)。將野外采集得到的樣品，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。通過(guò)外觀、解剖、顯微鏡檢查選擇其體型體態(tài)體色正常、無(wú)癤瘡、無(wú)囊腫、無(wú)充血、無(wú)出血、無(wú)潰瘍、無(wú)寄生蟲(chóng)或胞囊及其他病理變化的魚(yú)。在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d適應(yīng)其環(huán)境，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.1.2主要儀器與試劑

小型垂直電泳槽(Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad)；小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad)；全蛋白提取試劑盒(生工生物工程有限公司)；Pierce(R)BCA Protein Assay Kit(碧云天生物技術(shù)公司)；Tris-base(Biotopped)、SDS(Wolsen)；冰乙酸、甲醇、異丙醇、氯化鈉(均為：天津市富宇精細(xì)化工)；Tris-HCl(pH 8.8; 1.0 M)、Tris-HCl(pH 6.8; 1.5 M)、AP、TEMED、4×蛋白上樣緩沖液、Tween-20、考馬斯亮藍(lán)、PVDF膜、Pierce ECL Western Blotting Substrate、甘氨酸(均為：Solarbio)；蛋白marker、 RNAprep Pure Tissue Kit、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)、FastQuant RT Kit(Tiangen Biotech Co., Ltd)；封閉用脫脂奶粉、Anti-GAPDH(Sigma)、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔lgG(中杉金橋)、Anti-MSTN(上海英基生物)；KOD FX(TOYOBO)、HEK 293(ATCC)、內(nèi)切酶BsaI、XbaI(TaKara)、MetafecteneTM(Biontex公司)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建shRNA重組腺病毒載體

(1)干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)前期獲得的黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因序列[22]，利用晶賽公司Adenovirus Expression System重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，針對(duì)靶基因分別設(shè)計(jì)并合成兩種shRNA干擾載體。針對(duì)MSTN基因編碼區(qū)(1號(hào)：273-292；2號(hào)：250-268；3號(hào)：1737-1755；4號(hào)：1670-1688；5號(hào)：195-215)設(shè)計(jì)特異性插入片段序列。1P3：在1、2、3號(hào)區(qū)域設(shè)計(jì)三條干擾片段；1P2：在4、5號(hào)區(qū)域設(shè)計(jì)兩條干擾片段，橫線部位為基因特異性序列(見(jiàn)表1)。以pGenesil-10為底物進(jìn)行重組PCR，獲得干擾質(zhì)粒。

表1　黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因 shRNA 干擾片段

(2)包裝腺病毒載體

所需的shRNA表達(dá)框已成功構(gòu)建在pGenesil上。從pGenesil上通過(guò)LR體外同源重組將shRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)移至有熒光蛋白的腺病毒表達(dá)載體pad上。用DNA純化試劑盒(天根)提取質(zhì)粒，用XbaI單酶切進(jìn)一步鑒定提取的質(zhì)粒。準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染的線性化腺病毒DNA，用PacI酶切重組腺病毒質(zhì)粒。從而可以用PacI線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK 293和放大培養(yǎng)重組腺病毒，檢測(cè)重組腺病毒的滴度。

1.2.2黃河裸裂尻魚(yú)活體注射重組腺病毒

將前期飼養(yǎng)并已適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的黃河裸裂尻魚(yú)，進(jìn)行分組：1P3組(RNA干擾組1，6尾)；1P2組(RNA干擾組2，6尾)；HK組(腺病毒通用陰性對(duì)照組，6尾)；N組(正?？瞻讓?duì)照組，6尾)。對(duì)1P3組和1P2組進(jìn)行右側(cè)背鰭部肌肉注射腺病毒載體溶液20 μL，重組腺病毒滴度為5.0×1010pfu/mL。在相同的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)HK組背鰭右側(cè)肌肉注射相同量的空病毒載體溶液。N組不做任何處理，飼養(yǎng)條件同以上三組。在注射10 d后分取各組實(shí)驗(yàn)魚(yú)右側(cè)背鰭肌肉，用real-time PCR和Western blotting 檢測(cè)MSTN的表達(dá)量，分析干擾效率。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)RNA干擾后MSTN基因表達(dá)以及對(duì)下游基因M-CK的影響

分別取四組黃河裸裂尻魚(yú)右側(cè)背鰭部肌肉組織，提取總RNA，利用FastQuant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依照SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒進(jìn)行real-time PCR分析。Real-time PCR反應(yīng)體系20 μL：2× SuperReal PreMix Plus10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.4 μL。Real-time PCR時(shí)，每份樣品重復(fù)3次，GAPDH為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表2。結(jié)果采用2-ΔΔct法分析[23]。

表2　黃河裸裂尻魚(yú)RNA干擾分析引物

1.2.4Western-blotting檢測(cè)RNA干擾后MSTN基因的表達(dá)量

取4組黃河裸裂尻魚(yú)背鰭部肌肉組織，利用全蛋白提取試劑盒，提取總蛋白質(zhì)，依照Pierce(R)BCA Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。4×蛋白上樣緩沖液與蛋白按照1∶3的比例進(jìn)行混合后，99℃ 變性10 min， -80℃保存。統(tǒng)一上樣量，利用SDS-PAGE試劑盒使用說(shuō)明，配制10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)。60 V恒壓電泳25 min左右，樣品到達(dá)分離膠與濃縮膠分界處時(shí)調(diào)整電壓為120 V恒壓電泳65 min左右。利用甲醛溶液侵泡1 min激活PVDF膜，用于轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)膜時(shí)100 mA恒流轉(zhuǎn)印50 min左右。將固定好的PVDF膜置于5% TBST配制的脫脂奶粉溶液，37℃封閉2 h。將PVDF膜和TBST 1∶1000配制好的一抗置于孵育袋12 h。PVDF膜洗滌10次，每次6 min。置于TBTS 1-5000配置好的二抗孵育液，室溫孵育2 h，用TBST洗滌5次，每遍6 min。將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，用ECL顯色。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行膠片曝光。

2　結(jié)果與分析

2.1腺病毒載體的構(gòu)建

2.1.1shRNA干擾載體的構(gòu)建

1P3載體以pGenesil-10為底物進(jìn)行重組PCR，獲得1P3干擾質(zhì)粒PG10-3P-MSTN (Mir30 3’-DSP MSTN 273- Mir30 5’-EGFP-CMV-U6 Promoter- DSP MSTN 250-DSP MSTN 1737-H1 Promoter)。1P2載體，以 pGenesil-10為底物進(jìn)行重組PCR，獲得干擾質(zhì)粒PG10-2P-MSTN(Mir30 3’-DSP MSTN 195-Mir30 5’-EGFP-CMV-U6-DSP MSTN 1670)(見(jiàn)圖1)。

2.1.2包裝重組腺病毒

從pGenesil上通過(guò)LR體外同源重組將shRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)移至腺病毒表達(dá)載體pad上。提取質(zhì)粒并用XbaI進(jìn)行單酶切進(jìn)一步鑒定提取的質(zhì)粒，1% agarose凝膠電泳。酶切結(jié)果分析：正確的克隆將切出一條約2.5 kb的小條帶，且大條帶大于15 kb (說(shuō)明載體為腺病毒載體)，從上圖可知目的克隆是正確的(見(jiàn)圖2)。目的重組腺病毒中有熒光蛋白真核表達(dá)框。所以，在PacI線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK 293和放大培養(yǎng)重組腺病毒的過(guò)程中有明顯的熒光蛋白表達(dá)，即說(shuō)明有感染能力的重組腺病毒包裝成功(見(jiàn)圖3)。

2.2Real-time PCR 檢測(cè)黃河裸裂尻魚(yú)RNA干擾后MSTN的相對(duì)表達(dá)量

Real-time PCR分析結(jié)果表明，當(dāng)以N組表達(dá)量作為參考時(shí)，1P3和1P2組表達(dá)量分別是N組表達(dá)量的0.465和0.89倍。所以，與HK組和N組相比，重組腺病毒載體1P3對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)肌肉MSTN基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的干擾作用(P<0.05)，抑制率達(dá)53.5%；而重組腺病毒載體1P2對(duì)MSTN基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯干擾作用(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

2.3Western-blotting測(cè)定RNA干擾對(duì)MSTN蛋白相對(duì)表達(dá)情況

Western-blotting結(jié)果表明，當(dāng)以N組表達(dá)量作為參考時(shí)，1P3和1P2組表達(dá)量分別是N組表達(dá)量的0.479和0.765倍。所以，與N組和HK組相比，重組腺病毒載體1P3對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)肌肉MSTN基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的干擾作用(P<0.05)，干擾效率可達(dá)52.1%。 P2組干擾效率不明顯(P>0.05)(見(jiàn)圖5)。

2.4Real-time PCR 檢測(cè)黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因RNA干擾后對(duì)下游基因M-CK的表達(dá)調(diào)控

經(jīng)1P3干擾后隨著MSTN基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，其肌肉肌酸激酶M-CK基因表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，以N組表達(dá)量作為參考時(shí)(見(jiàn)圖6)，1P3組M-CK表達(dá)量是N組表達(dá)量2.437倍。

3　討論

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)兩種shRNA分別為1P3和1P2，并成功包裝成重組腺病毒。將重組腺病毒注射到黃河裸裂尻魚(yú)右側(cè)背鰭部，檢測(cè)RNA干擾后MSTN基因的表達(dá)量。Real-time PCR分析結(jié)果表明，與HK組和N組相比，重組腺病毒載體1P3對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)肌肉MSTN基因的轉(zhuǎn)錄具有明顯的干擾作用(P<0.05)，抑制率達(dá)53.5%；而重組腺病毒載體1P2對(duì)MSTN基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯干擾作用(P>0.05)。Western-blotting分析結(jié)果與real-time PCR結(jié)果相一致。表明，RNA干擾后MSTN基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平是一致的。經(jīng)1P3干擾后隨著MSTN基因轉(zhuǎn)錄水平的下降，其肌酸激酶M-CK基因表達(dá)水平顯著上升。能夠有效的干擾MSTN基因，這對(duì)今土著魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育提供基礎(chǔ)資料。有助于高原土著魚(yú)類(lèi)生態(tài)適應(yīng)機(jī)制、保護(hù)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)的深入研究。

注：A：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡圖；B：擴(kuò)大培養(yǎng)重組腺病毒后熒光顯微鏡圖。圖3　熒光顯微鏡檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞Note: A: Plasmid transfection with fluorescence microscopy; B: Expanded culture of recombinant adenovirus with fluorescence microscopy.Fig.3　Adenovirus-transfected HEK 293 cells were detected by fluorescence microscopy

圖1　構(gòu)建質(zhì)粒圖譜Fig.1　Construction of the plasmid profiles

注：M1: 2000 marker (Takara)：從上到下依次為2×103、1×103、750、500、250、100 bp;M2: 500-15 000 marker (Takara)：從上到下依次為：15、8、5、2.5、1 kb；A: pad- DSP MSTN 273+250+1737 XbaI單酶切鑒定結(jié)果；B: pad- DSP MSTN 195+ 1670 XbaI單酶切鑒定結(jié)果。圖2　shRNA質(zhì)粒XbaI單酶切檢測(cè)Note. M1: 2000 marker (Takara): 2 kb, 1 kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp; M2: 500-15000 marke r(Takara): 15 kb, 8 kb, 5 kb, 2.5 kb, 1 kb, 0.5 kb; A: pad- DSP MSTN 273+250+1737 XbaI single enzyme identification results; B: pad- DSP MSTN 195+ 1670 XbaI single enzyme identification results.Fig.2　Detection of shRNA plasmids using XbaI single enzyme digestion

注：上標(biāo)不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖4　RNA干擾后肌肉組織cDNA樣品中MSTN基因表達(dá)量Note. Different letters in superscript indicate significant difference (P<0.05).Fig.4　Relative expression of MSTN gene in the cDNA samples of muscle after RNA interference

注：上標(biāo)不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖5　RNA干擾后黃河裸裂尻魚(yú)MSTN蛋白的表達(dá)結(jié)果Note. Different letters in superscript indicate significant difference (P<0.05).Fig.5　Expression of MSTN protein from Schizopygopsis pylzovi after RNA interference.

注：上標(biāo)不同字母表示差異有顯著性(P<0.05)。圖6　MSTN基因RNA干擾后M-CK基因的相對(duì)表達(dá)量Note. Different letters in superscript indicate significant difference (P<0.05).Fig.6　The relative expression of M-CK gene after RNA interference of MSTN gene

肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育除了與細(xì)胞分化因子(myogenic differentiation, MyoD)家族特異基因啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合而激活肌肉特異蛋白的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控肌肉分化和發(fā)育外，還受到特異性肌細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子2(myocyte enhancer-binding factor 2, MEF2)的調(diào)控。MEF2能夠在肌肉發(fā)育過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)胞的分化，控制肌細(xì)胞分化過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄，可與大多數(shù)肌肉的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子直接結(jié)合而調(diào)控肌肉的發(fā)育[24]。轉(zhuǎn)錄因子 MEF2 的DNA 結(jié)合位點(diǎn)是一段保守的序列， 該序列廣泛存在于肌肉組織特異性表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)， MEF2 與MyoD 基因家族成員具有協(xié)同作用， 共同調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育[25]。由于MEF2具有DNA的結(jié)合活性，所以可與肌肉肌酸激酶基因啟動(dòng)子中的A/T DNA序列結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育[26]。肌肉肌酸激酶的另一重要生物學(xué)功能就是與動(dòng)物骨骼肌的形成和生長(zhǎng)有關(guān)，M-CK作為MyoD和MEF2的下游靶基因，啟動(dòng)與肌細(xì)胞分化和肌肉生長(zhǎng)有關(guān)的基因的表達(dá)[11]。同時(shí)，2002 年Spiller等[27]發(fā)現(xiàn)MSTN啟動(dòng)子序列上存在肌肉增強(qiáng)子因子 2的結(jié)合位點(diǎn)，它們對(duì)MSTN基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)起到一定的調(diào)控作用[27]。本研究通過(guò)對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因進(jìn)行RNA干擾后。結(jié)果表明，抑制MSTN基因的表達(dá)，在一定程度上能夠上調(diào)M-CK基因的表達(dá)量。因此，證明了在黃河裸裂尻魚(yú)中MSTN的表達(dá)在一定程度上能夠抑制M-CK的轉(zhuǎn)錄。但是，M-CK基因表達(dá)量的上升是否能夠引起肌細(xì)胞的增生和增殖？是否能夠促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育？還需進(jìn)一步研究。

黃河裸裂尻魚(yú)是裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)的代表種，在青藏高原淡水生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中具有重要的地位。但是，同裂腹魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)一樣，黃河裸裂尻魚(yú)固有的生物學(xué)特性，如生長(zhǎng)期短、生長(zhǎng)緩慢、性成熟遲、繁殖力低等，極大地限制了該種群的發(fā)展。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)首次對(duì)黃河裸裂尻魚(yú)MSTN基因進(jìn)行干擾，并檢測(cè)MSTN表達(dá)水平和下游基因的轉(zhuǎn)錄水平。這對(duì)今后研究高原土著魚(yú)類(lèi)MSTN基因在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)，具有一定的科學(xué)意義。

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Inhibitory effect of RNA interference of MSTN gene expression on the downstream genes inSchizopygopsispylzovi

KONG Qing-hui1, CHAO yan1, XIA Ming-zhe2, QI De-lin1*

(1.Animal Science Department of Agriculture and Animal Husbandry College, Qinghai University, Xining 810016, China;2.College of Eco-Environmental Engineering, Qinghai University, Xining 810016)

Objective To investigate the silencing effect of RNA interference onMSTNgene (myostatin, MSTN) expression, and detect the effects on the downstream genes inSchizopygopsispylzovi. MethodsTo construct the recombinant adenovirus vector 1P3 (DSP MSTN 273+250+1737) and 1P2 (DSP MSTN 195+ 1670) for RNA interference of theMSTNgene inSchizopygopsispylzovi, and to conduct the RNA interference in vivo experiment by injecting the vector into the muscle tissue ofSchizopygopsispylzovi. Real-time PCR and Western blotting were used to evaluate the silencing effects onMSTNgene expression, and to detect the regulatory function ofM-CKat gene transcription level after RNA interference of the MSTN gene. ResultsThe result of real-time PCR showed that compared with the HK team (Virus general negative control group) and N team (blank control group), the 1P3 had significant interference effect on theMSTNgene transcription inSchizopygopsispylzovi(P<0.05), with an inhibition rate of 53.5%, but the 1P2 had no significant interference effect on the MSTN gene transcription. The result of Western blotting was consistent with the results of real-time PCR. At the same time, after the 1P3 interference, the level ofMSTNgene transcription was declined, and the level ofM-CKgene expression was significantly increased. ConclusionsOur results demonstrate that the expression ofMSTNgene can be effectively suppressed, and the expression ofM-CKgene can be up-regulated through the RNA interference. Therefore, it proves thatMSTNgene can inhibit the transcription ofM-CKgene inSchizopygopsispylzovi, and reveals the regulatory role of MSTN gene in the muscle growth and development in the plateau fishSchizopygopsispylzovi.

Schizopygopsispylzovi; RNA interference; Myostatin; Creatine kinase; Expression

QI De-lin. E-mail: delinqi@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 31160226; No. 31460094 )。

孔慶輝 (1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)。 E-mail: kc1008611@163.com

祁得林，男，博士，教授；研究方向：動(dòng)物分子遺傳與生態(tài)學(xué)。 E-mail: delinqi@126.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)04-0344-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.04.003

2016-01-08