李成成,尤曉蒙,付　珺,鎖　然,*

(1.邢臺市疾病預(yù)防控制中心,河北邢臺 054000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北保定　071001;3.河北省眼科醫(yī)院,河北邢臺 054001)

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高效液相色譜測定飼料中色氨酸含量方法的研究

李成成1,尤曉蒙2,付珺3,鎖然2,*

(1.邢臺市疾病預(yù)防控制中心,河北邢臺 054000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北保定071001;3.河北省眼科醫(yī)院,河北邢臺 054001)

建立了飼料中色氨酸的高效液相色譜分析方法。飼料樣品通過氫氧化鋰提取,采用C18色譜柱,醋酸鹽緩沖液和甲醇為流動相等度洗脫,二級陣列管檢測器280 nm波長下檢測。實驗結(jié)果表明:標(biāo)準(zhǔn)曲線在25～500 mg/L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)r=0.9998,加標(biāo)回收率為88.33%～105.04%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.80%～5.97%之間,飼料中色氨酸檢出限為18.3 mg/kg。本方法準(zhǔn)確可靠,適用于飼料中色氨酸的測定。

色氨酸,飼料,堿水解,高效液相色譜法

色氨酸對動物的生長發(fā)育起到了至關(guān)重要的作用,通常動物不能通過自身合成色氨酸,只能從飼料中攝取,但在飼料市場上,一般的飼料色氨酸含量低,不能滿足動物的需要,所以,色氨酸是重要的氨基酸飼料添加劑之一[1]。

目前,飼料常規(guī)的氨基酸測定方法不能直接測定色氨酸,因為在酸性水解條件下色氨酸幾乎全都被破壞,所以只能單獨(dú)測定[2]。飼料中色氨酸普遍采用強(qiáng)堿水解樣品,采用分光光度、熒光、毛細(xì)管電泳、液質(zhì)聯(lián)用[3-6]的方法檢測。常用的堿水解法,強(qiáng)堿水解的同時,水解劑、濃度和用量選擇不當(dāng)會對色胺酸結(jié)構(gòu)造成破壞[7]。采用分光光度及熒光法,色氨酸檢出限高、雜質(zhì)干擾強(qiáng);采用毛細(xì)管電泳、液質(zhì)聯(lián)用法測定,儀器昂貴,方法不易推廣。本文選取常見的動物性和植物性飼料為研究對象,采用堿法水解和高效液相色譜測定,通過對樣品前處理和色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了操作簡單、準(zhǔn)確度高的色氨酸檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)對照品美國Sanland公司;甲醇色譜純,賽默飛世爾科技有限公司;冰乙酸色譜純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;氮?dú)饧兌取?9.999%,保定市三教制氧站,其他試劑均為分析純,實驗用水為超純水。進(jìn)口魚粉、豆粕、麥麩、玉米、豬飼料、雞飼料均購于農(nóng)貿(mào)市場。

Waters e2695高效液相色譜儀,配二極管陣列管檢測器美國Waters公司;高速中藥粉碎機(jī)浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;臺式低速離心機(jī)湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;QL-861渦旋混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司;PHS-3C型pH計梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取色氨酸0.1 g(精確到0.0001 g)置于100 mL的容量瓶中,用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液定容,搖勻,得到1000 mg/L的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液,4 ℃保存。然后逐級稀釋,得到濃度為25、50、100、200、300、400、500 mg/L的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品前處理將樣品用高速中藥粉碎機(jī)粉碎,過40目篩,稱取0.3 g(精確到0.0001 g)樣品于安培瓶中。植物性飼料樣品加入5 mol/L的氫氧化鋰4 mL,通入高純氮?dú)?馬上擰緊瓶蓋,放入110 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中水解24 h;動物性飼料樣品加入5 mol/L的氫氧化鋰1.5 mL,通入高純氮?dú)?馬上擰緊瓶蓋,放入110 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中水解16 h。取出冷卻后,將水解液轉(zhuǎn)移到50 mL的容量瓶中,用乙酸鈉緩沖液潤洗安培瓶,將潤洗液轉(zhuǎn)移到容量瓶中,加入6 mol/L的鹽酸7.5 mL中和,再用乙酸鈉緩沖液定容,搖勻,然后在4000 r/min的離心機(jī)中離心10 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,高效液相色譜儀檢測。

1.2.3色譜分析條件美國 Kromat Universil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為純甲醇;流動相B為乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.0085 mol/L乙酸鈉溶液用冰乙酸調(diào)pH為4.00±0.05;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫32 ℃;紫外檢測波長280 nm;等度洗脫,流動相A∶流動相B=10∶90。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1堿解劑的選擇比較了常用的氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀三種堿解劑[8-10]對豆粕和魚粉在相同的條件下色氨酸的堿解效果。結(jié)果表明,對于同一種樣品,用氫氧化鋰做堿解劑時色氨酸的水解效果最好,氫氧化鈉和氫氧化鉀色氨酸水解效果相當(dāng)。因此,選取氫氧化鋰為堿解劑。

2.1.2堿解劑濃度的選擇分別選取2、3、4、5、6 mol/L的氫氧化鋰,不同堿解劑濃度對色氨酸峰面積的影響如圖1所示。隨著堿解劑濃度的增大,色氨酸的峰面積也隨之增大,當(dāng)堿解劑的濃度為5 mol/L時,色氨酸的峰面積達(dá)到最大值,繼續(xù)增加堿解劑的濃度,色氨酸的峰面積呈下降趨勢。對于不同基質(zhì)的樣品,堿解劑濃度對色氨酸的峰面積趨勢相同。由此確定堿解劑的濃度為5 mol/L。

圖1　堿解劑濃度對色氨酸峰面積的影響Fig.1　Influence of the concentration of alkaline hydrolysis agent on the peak area of tryptophan

2.1.3堿解劑用量的選擇在相同條件下分別加入不同劑量的氫氧化鋰,不同堿解劑用量對色氨酸峰面積的影響如圖2所示。對于同一種樣品,隨著堿解劑用量的增加,色氨酸的峰面積逐漸增大,當(dāng)增加到一定值時,色氨酸的峰面積最大,繼續(xù)加大堿解劑的用量,色氨酸的峰面積減小。對于不同基質(zhì)的樣品,當(dāng)堿解劑用量為4 mL時,豆粕中色氨酸的面積達(dá)到最大值;當(dāng)堿解劑用量為1.5 mL時,魚粉中色氨酸的面積達(dá)到最大值。因此確定豆粕等植物性樣品堿解劑用量為4 mL,魚粉等動物性樣品堿解劑用量為1.5 mL。

圖2　堿解劑用量對色氨酸峰面積的影響Fig.2　Influence of the dosage of alkaline hydrolysis agent on the peak area of tryptophan

2.1.4堿解時間和溫度的選擇對比了不同時間和溫度對色氨酸測定的影響,實驗結(jié)果表明,對于同一樣品,隨著堿解時間的增加,色氨酸的峰面積也隨著增大,當(dāng)堿解的時間增大到一定值時,色氨酸的峰面積達(dá)到最大值。繼續(xù)增長堿解時間,色氨酸的峰面積減小。當(dāng)堿解的時間為24 h時,豆粕中色氨酸的面積達(dá)到最大值;當(dāng)堿解的時間為16 h時,魚粉中色氨酸的面積達(dá)到最大值。同一種樣品,隨著溫度的增高,色氨酸的峰面積逐漸增大,當(dāng)溫度增高到110 ℃時,色氨酸的峰面積最大,溫度繼續(xù)增高,色氨酸的面積呈下降趨勢。堿解溫度對兩種樣品中色氨酸的影響趨勢相同。因此,確定豆粕等植物性樣品堿解的時間為24 h,魚粉等動物性樣品堿解的時間為16 h,堿解溫度為110 ℃。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動相的選擇本實驗用冰乙酸調(diào)流動相的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0,結(jié)果顯示,在不同pH條件下,色氨酸的峰面積與保留時間沒有明顯的變化,但是當(dāng)pH4.0時,色氨酸色譜峰的峰寬最小,對稱因子最大。流動相中有機(jī)相的比例越大,色譜峰的保留時間越短,色譜峰出峰越快。本實驗在其他條件相同下,分別實驗了甲醇的體積百分比為5%、10%、15%時,進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液進(jìn)行分析。色譜圖顯示,當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%時,分析時間較長;而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為15%時,樣品溶液分離的效果不好;只有當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%時,分離效果最好,出峰時間相對較短。

2.2.2檢測波長的選擇因為色氨酸結(jié)構(gòu)中存在共軛雙鍵,所以有紫外吸收。本實驗用二極管陣列檢測器在210～400 nm波長范圍下掃描,結(jié)果顯示,色氨酸在219.6 nm和280.8 nm波長下有較強(qiáng)的紫外吸收,為了避免溶劑和其他雜質(zhì)干擾,所以本實驗選擇色氨酸的檢測波長為280 nm。

2.3方法線性關(guān)系和檢出限

分別取濃度為25、50、100、200、300、400、500 mg/L的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL用以上優(yōu)化好的色譜條件分離,二極管陣列檢測器檢測,以色氨酸的濃度為橫坐標(biāo)X,面積為縱坐標(biāo)Y,繪制出色氨酸濃度與其峰面積之間的線性回歸方程,Y=15600X-44100,線性范圍為25～500 mg/L,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9998。分別以3倍噪音水平和10倍噪音水平對應(yīng)的濃度確定檢出限和定量限,本方法檢出限為18.3 mg/kg、定量限為166.7 mg/kg。

2.4方法的精密度和準(zhǔn)確度

按照1.2.2的方法分別對動物性飼料和植物性飼料進(jìn)行樣品前處理后,在相同條件下平行進(jìn)樣5次,精密度實驗RSD分別為0.74%、1.35%,結(jié)果見表1。將色氨酸提取液在室溫下放置0、1、2、3、4 d后在相同色譜條件下測定,本方法測定動物性飼料和植物性飼料中色氨酸日間穩(wěn)定性實驗RSD值分別為2.16%、1.72%。精密稱量動物性飼料和植物性飼料樣品分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液至4.17、16.67、33.33 mg/g三個水平,經(jīng)堿解后進(jìn)行分析測定,加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。

表1　檢測精密度結(jié)果Table 1　Precision of method

表2　回收率測定結(jié)果(n=5)Table 2　Results of spiked recovery test(n=5)

2.5樣品測定

用以上優(yōu)化好的前處理及色譜條件對飼料樣品進(jìn)行分析測定。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的色譜圖見圖3。準(zhǔn)確稱取不同飼料樣品,按以上優(yōu)化好的前處理方法及色譜分析方法測定樣品中色氨酸的含量,結(jié)果見表3。

圖3　標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)的色譜圖Fig.3　Chromatograms of standard solution(A)and sample(B)

樣品名稱色氨酸含量平均值(%)RSD值(%)進(jìn)口魚粉0.551.7豆粕0.521.2麥麩0.231.8玉米0.062.3雞料0.161.4豬料0.171.6

選取飼料樣品中都含有色氨酸,但含量不同。魚粉與豆粕中色氨酸的含量相差不多,均高于其他飼料;玉米中色氨酸含量最少。采用本實驗建立的方法對不同樣品進(jìn)行測定,RSD值在1.2%～2.3%之間,精密度較高,能夠滿足飼料樣品中色氨酸含量分析的要求。

3　結(jié)論

前處理方法對飼料中色氨酸含量的測定影響很大,本文對不同基質(zhì)飼料的堿解劑種類、堿解劑濃度、堿解劑用量、堿解時間、堿解溫度等對色氨酸的影響進(jìn)行了研究,優(yōu)選出了色氨酸堿解條件。同時,通過對高效液相色譜中流動相pH、有機(jī)洗脫溶劑、流動相組成和檢測波長等條件的研究,建立了飼料中色氨酸的高效液相色譜測定方法。本方法操作簡單,且具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性,能夠?qū)χ参镄院蛣游镄燥暳现猩彼徇M(jìn)行定量分析,是評價飼料質(zhì)量的有效手段。

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Study on determination of tryptophan in feedstuff by high performance liquid chromatography

LI Cheng-cheng1,YOU Xiao-meng2,FU Jun3,SUO Ran2,*

(1.Xingtai Center for Disease Control and Prevention,Xingtai 054000,China;2.Agriculture University of Hebei,Baoding 071001,China;3.Ophthalmologic Hospital of Hebei Province,Xingtai 054001,China)

A method for the determination of tryptophan in feedstuff was established by high performance liquid chromatography.The samples were extracted with lithium hydroxide solution.The analysis was carried out on a C18column with acetate buffer and acetonitrile in gradient elution.The analytes were detected with DAD detector,at 280 nm as detection wavelength.The linear ranges was good from 25 mg/L to 500 mg/L with correlation coefficient 0.9998.The standard addition recoveries were 88.33%～105.04% and the relative standard dviation(RSD)were 2.80%～5.97%.The detection limit of tryptophan was 18.3 mg/kg.The established methods were proved accurate and reliable,which can be used for the detection of tryptophan in feedstuff.

tryptophan;feedstuff;alkali hydrolysis;high performance liquid chromatography

2015-11-16

李成成(1981-)，男，碩士，主管技師，研究方向：理化檢驗工作，E-mail:lccpop1@163.com。

鎖然(1971-)，男，博士，教授，研究方向：食品檢測分析,E-mail:xtjkxx@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0308-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.051