莊奕筠　張　吟　高雅莉　許秋霞福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，福建泉州　362000

超高效液相色譜同時測定人血清中4種抗癲癇藥物的濃度

莊奕筠張吟▲高雅莉許秋霞
福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，福建泉州362000

目的 建立超高效液相色譜法測定人血清中卡馬西平（CBZ）、苯妥英鈉（PHT）、苯巴比妥（PB）、奧卡西平（OXC）活性代謝產(chǎn)物利卡西平（MHD）的濃度。方法 于2014年1月～2015年6月收集血清樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后直接進樣測定，采用Shim－pack XR－ODSⅢ柱（1．6 μm，75 L×2．0）。流動相為甲醇－水，采用梯度洗脫程序；掃描波長200~360 nm，檢測波長為210 nm，流速：0.4 mL/min，柱溫：35℃，進樣體積：10 μL。結果CBZ、PHT、PB、MHD均能達到良好分離，與相鄰峰的分離度（R）均＞1.5；線性范圍分別為（1.00~32.00）μg/mL（r=0.9997）、（2.55~ 81.60）μg/mL（r=0.9997）、（2.35~75.20）μg/mL（r=0.9999）、（2.50~80.00）μg/mL（r=0.9998）；方法回收率＞97%；日內(nèi)和日間精密度的相對標準偏差（RSD）均＜1.6%。結論 超高效液相色譜法（UPLC）快速、簡便、準確，適用于臨床治療藥物監(jiān)測。

卡馬西平；苯妥英鈉；苯巴比妥；奧卡西平；利卡西平；超高效液相色譜法；血藥濃度

[Abstract]Objective To establish a simple UPLC method for the simultaneous determination of carbamazepine(CBZ), phenytoin sodium(PHT),phenobarbital(PB),active metabolite of oxcarbazpine(OXC)-licarbazepine(MHD)in human serum.Methods The analytes were extracted by methanol protein precipitation in our hospital from January 2014 to June 2015.The extracts were injected onto an Shim-pack XR-ODSⅢcolumn.The mobile phase was methanol-water by gradient elution.The wavelength for scanning ranged from 200-360 nm,and the detective wavelength was 210 nm. The flow rate was 0.4 mL/min,and the column temperature was set at 35°C.The volume of loading sample was 10 μL. Results Carbamazepine,phenytoin sodium,phenobarbital and licarbazepine were separated well under the chromatographic condition,with the degree of separation(R)of adjacent peaks were greater than 1.5.The method was found to be linear over the concentration ranges investigated,1.00-32.00 μg/mL(r=0.9997)for CBZ,2.55-81.60 μg/mL(r=0.9997) for PHT,2.35-75.20 μg/mL(r=0.9999)for PB,2.50-80.00 μg/mL(r=0.9998)for MHD.The recoveries of CBZ,PHT,PB, OXC were more than 97%,and the intra-and inter-day validation were adequate with the RSDs of 1.6%or below. Conclusion UPLC is proved to be convenient,accurate and suitable to measure concentrations of the four analytes in clinical samples.

[Key words]Carbamazepine;Phenytoin sodium;Phenobarbital;Oxcarbazpine;Licarbazepine;UPLC;Serum concentration

卡馬西平（carbamazepine，CBZ）、苯妥英鈉（phenytoin sodium，PHT）、苯巴比妥（phenobarbital，PB）為臨床上常用的傳統(tǒng)一線抗癲癇藥物，由于這三種抗癲癇藥物的有效血藥濃度范圍較窄，患者之間個體差異較大，抗癲癇作用和毒性與在體內(nèi)的血藥濃度有很大的相關性，需要進行血藥濃度監(jiān)測和個體化給藥。奧卡西平（oxcarbazepine，OXC）是新型抗癲癇藥，2011年我國專家共識建議將其作為新診斷癥狀性部分性癲癇一線用藥[1]，是聯(lián)合治療癥狀性部分性癲癇的首選配伍之一。OXC主要代謝產(chǎn)物是10-單羥基衍生物利卡西平（licarbazepine，MHD），體內(nèi)真正起作用的有效成分是其代謝產(chǎn)物MHD[2-7]，目前臨床上多監(jiān)測MHD；OXC抗癲癇作用與CBZ、PHT和丙戊酸鈉相似，但其具有更好的耐受性。目前臨床上CBZ、PHT、PB、OXC除單一治療外，臨床上還存在多藥聯(lián)合應用治療難治性癲癇，故研究建立同時測定人血清中這4種抗癲癇藥物濃度的方法，對這類藥物進行血藥濃度監(jiān)測[8，9]。為提高血藥濃度監(jiān)測的工作效率，本研究利用甲醇一步法沉淀蛋白處理血樣，建立了同時測定此四種藥物的UPLC方法，并測定了我院2014年1月~2015年6月的患者血樣。該方法快速、準確、專屬性強，可滿足臨床血藥濃度測定的需求，為實施個體化給藥、保證臨床用藥安全和有效奠定基礎，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1材料

甲醇（HPLC級，批號：MS1922-001，美國TEDIA公司）；CBZ對照品（批號：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院）；PHT對照品（批號：100210-201303，中國食品藥品檢定研究院）；PB對照品（批號：171222-200605，中國食品藥品檢定研究院）；MHD對照品（批號：20131227，南京康滿林生物醫(yī)藥科技有限公司）；空白血漿（本院體檢中心，健康體檢者的混合血漿）；其他試劑為分析純。

1.2儀器

超高效液相色譜儀，配有SPD-M20A二極管陣列檢測器以及LC solution色譜工作站（LC-30AD，日本島津公司）；離心機（2-5k，德國Sigma公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-Qacademic，美國Millipore公司）。

1.3色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱Shim-pack XR-ODSⅢ柱（1.6 μm，75 L×2.0，日本島津公司）；梯度洗脫，見表1；流速0.4 mL/min，溫度：35℃，進樣體積：10 μL。

表1　梯度洗脫程序

1.4溶液的制備

1.4.1對照品貯備液的制備精密稱取CBZ、PHT、PB、MHD對照品各適量，精密稱量，用甲醇溶解得到質(zhì)量濃度分別為1.00、1.02、0.94、1.00 mg/mL的儲備液，置于-20℃冰箱中貯存。

1.4.2標準血樣的制備分別精密量取對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成為適當濃度的系列混合工作液。取此工作液，加入適量空白人血清，制成含CBZ 1.00、 2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL，含PHT 2.55、5.10、10.20、20.40、40.80、81.60 μg/mL，含PB 2.35、4.70、9.40、18.80、37.60、75.20 μg/mL，含 MHD 2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg/mL的系列混合標準血樣。

1.4.3質(zhì)控血清的制備分別精密量取對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成為低、中、高對照品混合溶液。取此對照品混合溶液，加入適量空白人血清，制成含CBZ 3.00、6.00、20.00 μg/mL，含PHT 8.75、17.50、35.00 μg/mL，含PB 5.87、11.75、47.00 μg/mL，含MHD 6.25、12.50、50.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)控血清。

1.4.4血清樣品預處理精密量取血清樣品200 μL，加800 μL甲醇沉淀蛋白，旋渦混勻1 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾器濾過，取10 μL進樣上機。

2　結果

2.1方法的專屬性

在選定的樣品處理方法和色譜分離條件下，CBZ、PHT、PB、MHD能夠得到良好分離，峰形較好，與相鄰峰的分離度（R）均＞1.5，且血清的內(nèi)源性物質(zhì)對本法測定無干擾，保留時間（retention time，RT）分別為9.87、8.96、7.12、7.65 min。測得空白血漿、空白血漿加對照品、患者服藥后血樣的色譜圖，見圖1。

在血清中加入可能與目標待測物聯(lián)合使用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物，如舒必利（RT：2.42 min）、尼可剎米（RT：4.56 min）、多索茶堿（RT：5.68 min）、東莨菪堿（RT：6.44 min）、氯丙嗪（RT：10.25 min）、地西泮（RT：11.47 min）、阿普唑侖（RT：10.49 min）、艾司唑侖（RT：10.14 min）、氟奮乃靜（RT：11.12 min）、雙氯芬酸（RT：12.76 min）、布洛芬（RT：12.89 min）等，按色譜條件下檢測。結果顯示對實驗目標檢測均無干擾。

2.2線性關系考察與定量限

取系列混合標準血樣各200 μL，按1.4.4項下方法處理，取上清液10 μL進樣分析，以目標物峰面積Y對濃度X作線性回歸，得回歸方程與線性關系。結果表明：各藥物的峰面積與濃度均呈良好的線性關系，見表2。并以信噪比S/N=10，計算定量限（limit of quantity，LOQ）。

2.3精密度試驗

取低、中、高3個濃度質(zhì)控血清，按1.4.4方法處理，取上清液10 μL進樣分析。實驗于同日內(nèi)平行操作測定5次，計算得日內(nèi)相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）；連續(xù)5 d每天操作測定1次，計算得日間RSD。見表3。

圖1　4種藥物同時檢測的高效液相色譜圖

表2　UPLC法同時測定血清中CBZ、PB、PHT及MHD的標準曲線和線性范圍

2.4回收率試驗

取低、中、高3個濃度質(zhì)控血清，按1.4.4方法處理，每個濃度平行制備5份，取上清液10 μL進樣分析，根據(jù)所得圖形峰面積代入標準曲線求出各樣品濃度，求得的樣品濃度與理論的樣品濃度之比，即為方法回收率；由標準血樣經(jīng)提取后測得的峰面積與對應濃度對照品溶液測得的峰面積之比，計算提取回收率，見表3。

表3　UPLC法同時測定血清中CBZ、PB、PHT及MHD的方法回收率和精密度試驗

2.5穩(wěn)定性試驗

取對照品的儲備液，4℃冷藏保存，分別在1、3、5、7、60 d后，配制4種混合對照溶液100 μg/mL直接進樣測定（n=5），峰面積RSD均<5%，表明儲備液至少在60 d穩(wěn)定。

3　討論

本文采用甲醇沉淀蛋白的方法對血樣進行沉淀蛋白前處理，該方法簡單、快速。色譜條件的選擇尤其是流動相的組成直接影響到日常工作的開展。相關文獻[10-14]中使用的流動相均含有無機鹽或酸，平衡流動相和沖洗色譜柱時間較長，干擾因素多，不利于色譜柱的保護。本文采用的流動相為無鹽的甲醇-水體系，對色譜柱及儀器的損害小，柱子的沖洗也較簡單、快速。采用梯度洗脫可提高分離度、縮短分離時間和提高分離精度，但是由于流動相比例在不斷變化，背景會存在溶劑峰。

本文所采用的二極管陣列檢測器，能夠在給定的200~360 nm范圍內(nèi)實時采集每一色譜峰的光譜，并計算其最大吸收波長。通過多種波長下的吸光度比較，最后確定在210 nm處這四種藥物均有最大吸收，而且分離良好。柱溫選擇35℃可以降低柱壓，延長柱子的使用壽命。

本研究建立同時測定4種抗癲癇藥物的UPLC方法對于臨床常用舒必利等11種藥物進行檢測，與文中4種目標藥物不存在干擾，適用于臨床治療藥物血藥濃度的監(jiān)測。有研究收集臨床上服用CBZ、PHT、PB、OXC患者的血樣，應用建立的UPLC法測定58例患者的血藥濃度，年齡范圍在10~81歲，用本方法測定穩(wěn)態(tài)谷濃度。其中單獨應用一種藥物的病例43例，存在聯(lián)合應用兩種及以上藥物的病例有15例（部分血樣有聯(lián)合應用丙戊酸鈉VPA）。血藥濃度的監(jiān)測結果表明：在監(jiān)測的58例病例中，77.6%的患者血藥濃度在有效濃度范圍內(nèi)，臨床癥狀控制較好；15.5%的患者血藥濃度低于有效范圍；6.9%的患者血藥濃度高于有效濃度，患者出現(xiàn)中毒癥狀，服用PHT的患者特別是老年人較易中毒，其中有1例患者測得PHT血藥濃度高達84.94 μg/mL。在聯(lián)合用藥方面，常見的為CBZ、PHT或CBZ、VPA或OXC、VPA，也有存在PHT、OXC、

PB三種聯(lián)用的。因CBZ、PHT、PB、OXC及VPA等抗癲癇藥物經(jīng)常存在多種藥物聯(lián)合應用，藥物間相互作用，可能加速或抑制其他藥物的代謝，而影響藥物的療效，有必要對此類藥物進行血藥濃度監(jiān)測。由于患者存在個體差異，實施個體化給藥非常必要[15]。隨著臨床藥物監(jiān)測知識的普及和應用的深入，醫(yī)生通過監(jiān)測患者血藥濃度，結合臨床神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、患者并發(fā)癥、認知功能及影像學檢查，制訂調(diào)整給藥方案，實現(xiàn)個體化給藥，從而有效控制癲癇發(fā)作，提高治療效果。

[1]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦電圖與癲癇學組.抗癲癇藥物應用專家共識[J].中華神經(jīng)科雜志，2011，44（4）：56-64.

[2]陸志城，佘清聲.奧卡西平的藥代動力學及其立體選擇性[J].中國臨床藥理學雜志，2003，19（2）：134-137.

[3]張全英，徐文俊，俞蘊莉.高效液相色譜法測定癲癇患者血漿中奧卡西平活性代謝物的濃度及其血藥濃度與療效關系評價[J].中國生化藥物雜志，2015，35（1）：106-109.

[4]汝國慶.奧卡西平血藥濃度與癲癇治療療效的臨床研究[J].北方藥學，2014，11（12）：91-95.

[5]汪洋，宋新文，許瓊，等.癲癇患兒奧卡西平活性代謝產(chǎn)物血藥濃度監(jiān)測結果回顧分析[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2012，29（5）：464-465.

[6]鄒蓉，趙合慶，戴永萍，等.年齡及聯(lián)合用藥對癲癇患者奧卡西平血藥濃度的影響[J].臨床神經(jīng)病學雜志，2015， 28（2）：110-113.

[7]徐善森，張媞，周敬凱，等.高效液相色譜法測定人血漿中拉莫三嗪、奧卡西平及其代謝物濃度[J].中國臨床藥理學雜志，2015，31（12）：1176-1179.

[8]馮惠平，吳佳濱，李碧峰，等.反相高效液相色譜法同時測定苯妥英鈉、卡馬西平的血藥濃度[J].臨床醫(yī)藥，2008，17（7）：54-55.

[9]蘇煌財，林玉仙，張宏.高效液相色譜法同時測定苯妥英鈉和卡馬西平的血藥濃度[J].藥品評價，2012，9（26）：31-32.

[10]楊潔，焦正，施孝金.高效液相色譜法同時測定人血漿中6種抗癲癇藥物及兩種活性代謝物的濃度[J].中國藥學雜志，2006，41（24）：1899-1902.

[11]劉穎，王麗，何大可.RP-HPLC法同時測定卡馬西平拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英鈉及環(huán)氧卡馬西平的血清濃度[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10（8）：846-851.

[12]劉亦偉，王長連，黃品芳.高效液相色譜法同時測定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡馬西平的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2012，32（23）：1660-1662.

[13]董超，王來成，呂冬梅.苯妥英鈉血藥濃度監(jiān)測中的中毒影響因素分析[J].中國藥房，2012，23（44）：4185-4186.

[14]祝文兵，陽利龍，何周康.高效液相色譜法同時測定苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平血藥濃度[J].兒科藥學雜志，2015，21（6）：38-41.

[15]韓勇，陳東生，張玉.臨床藥學實驗室的藥物個體化治療藥學服務內(nèi)容與實踐[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2013，33（9）：739-741.

Study on simultaneous analysis of four antiepileptic drugs in human serum by UPLC

ZHUANG YijunZHANG YinGAO YaliXU Qiuxia
Department of Clinical Pharmaceutics Room,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China

R969

B

1673-9701（2016）12-0105-03

福建省科技廳社會發(fā)展引導性項目（2015Y00 55）；福建省衛(wèi)計委青年科研課題（2015-1-60）

2016-01-28）