陳雷 黃智慧 葉榮蘋 肖建新

NNMT基因多態(tài)性 血清內(nèi)脂素與非酒精性脂肪肝病的相關(guān)性

陳雷 黃智慧 葉榮蘋 肖建新

目的 探討NNMT基因多態(tài)性（rs694539） 及血清內(nèi)脂素（Visfatin）、同型半胱氨酸（Hcy）與非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）的相關(guān)性。方法 收集NAFLD患者與入組患者種族、年齡、性別相匹配健康志愿者為研究對象，利用聚合酶鏈限制性長度多態(tài)性分析（PCRRFLP）技術(shù)檢測NNMT基因多態(tài)性，酶聯(lián)免疫法測定所有患者的血內(nèi)脂素水平。結(jié)果 NAFLD組內(nèi)脂素水平較對照組高（P＜0.05），兩組間NNMT基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Logistic回歸分析GG基因型HCy水平為保護(hù)因素，ALT及visfatin水平為危險因素。隨訪期間NNMT基因GG與AA基因型間的累積轉(zhuǎn)歸有明顯差異Log Rank=5.460，P=0.019。結(jié)論 NNMT基因多態(tài)性（rs694539）與NAFLD發(fā)生具有相關(guān)性。NAFLD與血清visfatin水平相關(guān)，AA基因型增加NAFLD發(fā)生及進(jìn)展的風(fēng)險。

NNMT基因多態(tài)性 非酒精性脂肪性肝病 內(nèi)脂素

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激因素及與血脂異常、高胰島素血癥、2型糖尿病等相關(guān)因素所致，其發(fā)病具體機(jī)制尚未明確，研究認(rèn)為［1］，脂肪組織能分泌一系列蛋白，包括瘦素（1eptin）、脂聯(lián)素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、內(nèi)臟脂肪素（visfatin）等。同型半胱氨酸（Hcy）越高，血脂水平越高［2］。研究［3］顯示，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者血清Hcy水平較低，可以獨(dú)立預(yù)測NASH的存在。研究［4］證實(shí)，尼克酰胺N-甲基化酶（ NNMT） 基因參與Hcy代謝，NNMT基因多態(tài)性與NASH具有一定的相關(guān)性。本文探討NNMT基因多態(tài)性（rs694539） 及血清內(nèi)脂素、同型半胱氨酸與NAFLD的相關(guān)性。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2007年1月至2010年10月本院NAFLD患者100例（NAFLD組）。男47例，女53例；年齡17～78歲，平均（ 44.27±15.79）歲。另選擇同期150例健康體檢者為對照組，男78例，女72例；年齡18～81歲，平均年齡（46.05±16.97）歲。NAFLD診斷參照2006 年中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。兩組均排除酒精性脂肪肝（ALD）、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒆陨砻庖咝愿尾?、慢性丙型肝炎等?dǎo)致脂肪肝及藥物、炎癥性腸病、全胃腸外營養(yǎng)、庫欣綜合征、甲狀腺功能減退癥等導(dǎo)致脂肪肝；肝臟惡性腫瘤、感染和膽道疾病，以及正在服用或近期曾服用可導(dǎo)致肝臟酶譜升高的中西藥物。兩組研究對象均為無血緣關(guān)系的散發(fā)人群，本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者知情并簽署同意書。

1.2NNMT基因型檢測 （1）SNPs 的選擇基因多態(tài)性的檢測：從HapMap 數(shù)據(jù)庫漢族人群群體中選擇SNPs，基于Tagger 程序選擇標(biāo)簽SNPs，定義參數(shù)為r2≥0.80和少見等位基因頻率（MAF）≥5%最終選取代表性的SNPs rs694539位點(diǎn)（2）DNA提?。悍椒ㄑ永m(xù)前期研究方案［3］，晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒提取人類白細(xì)胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩NA提取試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）。（3）NNMT基因PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及電泳分析：方法延續(xù)前期研究方案［3］，用聚合酶鏈限制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術(shù)檢測NNMT基因多態(tài)性。NNMT基因可區(qū)分出3種基因型：即GG基因型（終產(chǎn)物為187bp的單一條帶），AG基因型（終產(chǎn)物為187 bp、106 bp、81 bp的三條帶），AA基因型（終產(chǎn)物為106bp、81bp的兩條帶）。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性，基因型及等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)，計量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)。以非條件性Logistic回歸模型分析基因型與NAFLD相關(guān)性。隨訪數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier法，log-rank法進(jìn)行檢驗(yàn)，并繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1NAFLD組與對照組各觀察指標(biāo)比較 兩組年齡、性別、超敏C反應(yīng)蛋白、TG、TC、HDL-C、LDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NAFLD組BMI、FPG、AST、ALT均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。NAFLD組Hcy及visfatin水平較對照組低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　NAFLD組與對照組各觀察指標(biāo)比較（±s）

表1　NAFLD組與對照組各觀察指標(biāo)比較（±s）

NAFLD組（n=100）　對照組（n=150）　χ2/t值　P值性別（男/女）　47/53　78/72　0.600　0.439年齡（歲）　44.27±15.79　46.05±16.97　-0.837　0.404 BMI　23.66±2.16　21.20±1.79　7.688　0.000 FPG（mmoI/L）　6.39±1.36　5.98±1.30　2.437　0.016 AST（U/L）　45.25±13.10　34.96±8.49　7.307　0.000 ALT（U/L）　97.78±29.4　34.08±8.34　25.086　0.000 TG（mmoI/L）　2.52±0.85　2.41±0.82　1.010　0.314 TC（mmoI/L）　5.42±0.86　5.38±0.87　-0.352　0.725 HDL-C（mmoI/L）　1.39±0.23　1.40±0.24　-0.428　0.669 LDL-C（mmoI/L）　2.76±0.44　2.69±0.39　1.371　0.172超敏C反應(yīng)蛋白（mg/L）　4.43±2.38　3.97±2.37　1.472　0.142 Hcy（μmol/L）　11.45±1.53　12.36±1.91　-3.980　0.000 visfatin （μg/L）　45.06±18.35　39.65±19.03　2.251　0.025

2.2兩組NNMT基因多態(tài)性比較 基因型頻率在兩組間NNMT基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組G型等位基因頻率分別為63.5%和75.0%，等位基因在兩組間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）。其次，GG基因型為NAFLD發(fā)病的保護(hù)因素（OR=0.577，95% C.I.=0.346-0.962； P=0.034），AA基因型為NAFLD發(fā)病的危險因素（OR=2.667，95% C.I.=1.157-6.147；P=0.018）。見表2。

表2　兩組NNMT基因多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率分布

2.3Hardy-Weinberg 平衡分析 NAFLD組和對照組NNMT基因多態(tài)性基因型Hardy-Weinberg 平衡分析，結(jié)果顯示，NAFLD組χ2=1.335；P=0.248，對照組χ2=0.074；P=0.785，可以認(rèn)為兩組趨向于遺傳平衡。

2.4不同基因型HCY及visfatin水平比較 NAFLD患者組內(nèi)NNMT基因多態(tài)性基因型HCY及visfatin水平比較，AA型HCY及visfatin水平較GG及GA型均顯著增高，組內(nèi)比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見表3。正常對照組內(nèi)HCY及visfatin水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表3　NAFLD患者不同基因型HCY及visfatin水平比較（±s）

表3　NAFLD患者不同基因型HCY及visfatin水平比較（±s）

注：與GG基因型比： *P＜0.05； 與GA基因型比： # P＜0.05

組別　n　HCY　visfatin GG基因型　36　11.82±1.47　39.37±16.04 GA基因型　32　11.28±1.59　44.91±19.39 AA基因型　32　10.11±1.50 *#　48.32±20.81*# F值　3.682　2.994 P值　0.019　0.038

表4　正常對照組不同基因型HCY及visfatin水平比較（±s）

表4　正常對照組不同基因型HCY及visfatin水平比較（±s）

組別　n　HCY　visfatin GG基因型　81　12.48±1.97　37.29±14.93 GA基因型　56　12.19±1.81　40.97±19.18 AA基因型　13　12.33±2.07　41.53±17.95 F值　0.392　2.263 P值　0.676　0.108

2.5相關(guān)分析及回歸分析 采用二分類非條件Logistic回歸分析NNMT基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)病的關(guān)系，納入多因素AST、ALT、BMI、TG、TC、Hcy情況下，最終進(jìn)入模型的因素：GG基因型（OR=0.249，95% C.I.=0.063-0.427； P=0.005），HCY水平（OR=0.917，95% C.I.=0.748-1.124； P=0.044） 為保護(hù)因素，ALT水平（OR=1.017，95% C.I.=1.006-1.027； P=0.002） 及visfatin水平（OR=1.265，95% C.I.=0.996-1.607； P=0.034）為危險因素，見表5。以復(fù)查NAFLD患者B超診斷評分為因變量（輕度1分，中度2分，重度3分），以visfatin、Hcy為自變量，然后進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Hcy 水平（r=-0.419，P=0.011）和B超診斷評分呈顯著負(fù)相關(guān)，visfatin（r=0. 447，P=0.015）為正相關(guān)。

表5　NAFLD易感基因多態(tài)性的logistic回歸分析

2.6NNMT基因多態(tài)性基因型與隨訪期間非酒精性肝病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系 250例受檢者中12例失訪，平均隨訪時間4年。隨訪過程中，以復(fù)查B超脂肪肝發(fā)生及程度加劇為終點(diǎn)事件，評價非酒精性肝病轉(zhuǎn)歸?？傮w上，新發(fā)及加重發(fā)生率31.20%（78/250）。而AA基因型中新發(fā)及加重發(fā)生率65.38%（17/26）。經(jīng)Kaplan-Meier法分析并繪制曲線后，隨訪期間NNMT基因GG與AA基因型間的累積轉(zhuǎn)歸有明顯差異Log Rank檢驗(yàn)統(tǒng)計量為5.460， P=0.019，見圖1。

圖1　NNMT基因不同基因型與隨訪期間非酒精性肝病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系

3　討論

近年來， 隨著人們生活水平的提高，NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，遺傳-環(huán)境及多元代謝紊亂的相互作用可能是其主要的發(fā)病因素。首先，本研究通過NAFLD組和對照組NNMT基因（rs694539）基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，提示兩組具有群體代表性。單因素分析，GG基因型為保護(hù)因素，AA基因型為危險因素。提示NNMT基因多態(tài)性（rs694539）與NAFLD的發(fā)病有相關(guān)性。國外Ali等［6］研究結(jié)果與本研究相似。其次，本資料結(jié)果提示，NAFLD患者中visfatin及Hcy水平較正常組低。Logistic回歸分析提示GG基因型，HCY為保護(hù)因素，ALT、visfatin為危險因素，且Hcy水平與肝臟脂肪變呈負(fù)相關(guān)，血清visfatin為正相關(guān)。最后隨訪過程中，兩組新發(fā)及加重發(fā)生率為31.20%（78/250）。而AA基因型中新發(fā)及加重發(fā)生率為65.38%（17/26）。累積陽性率NNMT基因GG 與AA基因型間有顯著差異。

根據(jù)上述結(jié)果，推測可能原因?yàn)椋海?）低水平Hcy抑制合成谷胱甘肽，上調(diào)組織對氧自由基反應(yīng)的敏感性，且對肝內(nèi)脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)與合成功能也有一定的上調(diào)作用。（2）人NNMT基因位于11號染色體長臂23.1，總長16.5kb， NNMT轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為cDNA TATA box/TCTAAAbox3'端后30bp處，其非編碼區(qū)存在高度多態(tài)性。NNMT基因的非編碼區(qū)rs694539基因多態(tài)性對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有較大的影響［7］。NNMT是S-腺苷-L蛋氨酸（SAM）依賴的一種胞質(zhì)酶，主要催化吡啶類及尼克酰胺物質(zhì)的甲基化，使之形成吡啶鹽。其通過甲基化S-腺苷蛋氨酸（SAM），使之形成N-甲基尼克酰胺，生成S-腺苷Hcy（SAH），后脫去腺苷合成Hcy，其活性強(qiáng)度與Hcy水平形成正相關(guān)聯(lián)系。Hcy水平的改變很大程度上受rs694539基因多態(tài)性影響。尤以GG基因型對NNMT酶活性影響較大。（3）visfatin通過調(diào)控血糖及模擬胰島素的作用，導(dǎo)致胰島素抵抗，使得脂肪組織在肝臟異常堆積，誘導(dǎo)肝臟的胰島素受體底物的磷酸化，通過不同于胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，激活受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮類似胰島素的生物學(xué)作用。誘導(dǎo)脂肪和肌肉組織中的葡萄糖攝取并抑制肝臟組織中葡萄糖生成［8］。

本試驗(yàn)通過比較分析NNMT基因多態(tài)性（rs694539）與NAFLD的相關(guān)性，NAFLD與血清visfatin及Hcy水平相關(guān)，研究分析顯示NNMT基因（rs694539）的A等位基因頻率為NAFLD的危險指標(biāo)，AA基因型人群更易發(fā)生NAFLD及其脂肪肝程度加劇。但結(jié)果仍需大規(guī)模大樣本試驗(yàn)證實(shí)。本研究不足之處，（1）樣本量仍偏小，結(jié)果仍有待擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。（2）由于技術(shù)原因，未能直接證實(shí)NNMT基因（rs694539）位點(diǎn)下游相關(guān)因子含量及其發(fā)生機(jī)制。（3）人群的其他生活習(xí)慣及環(huán)境因素控制欠佳。（4）仍需要進(jìn)行更大樣本量的前瞻性研究或相匹配的病例對照研究來進(jìn)一步明確是否rs694539位點(diǎn)多態(tài)性與NAFLD發(fā)生風(fēng)險相關(guān)，減少偏倚。將在后續(xù)研究中補(bǔ)足本研究欠缺之處。

綜上所述，NNMT基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)病具有一定的相關(guān)性，但這一結(jié)論有待于更大規(guī)模、包含更多調(diào)查變量的隨機(jī)試驗(yàn)加以證明。

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Objective The aim of this study was to investigate the possible role of nicotinamide-N-methyltransferase （NNMT） gene rs694539 variant in the development of NAFLD and visfatin. Methods We analyzed NAFLD patients and healthy controls using a polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）method developed in our laboratory. ELISA technique was employed to determine the plasma visfatin concentration.Results The visfatin levels of NAFLD group were higher than control group （P＜0.05）.The NNMT rs694539 variant was found to be significantly associated with NAFLD. Logistic regression analysis of GG genotype and HCY levels were the protect factors， ALT and visfatin level for the risk factors. Follow-up period NNMT gene GG and AA genotype cumulative outcome have obvious differences between the Log Rank=5.460，P=0.019. Conclusion The rs694539 variant of NNMT gene is associated with NAFLD. NAFLD is associated with serum visfatin level， AA genotype increases the risk of deelopment and progression of NAFLD.

NNMT Gene Polymorphism Nonalcoholic Steatohepatitis visfatin

浙江省溫州市科技計劃項(xiàng)目（Y20140089；Y20130363）

325000 浙江溫州 解放軍第118醫(yī)院消化內(nèi)科