基礎(chǔ)研究

慢性血栓栓塞性肺動脈高壓基因表達(dá)譜的研究

李廣輝 劉巖 蘇丕雄 張希濤 安向光 高杰 顧松

目的 利用基因表達(dá)譜芯片研究慢性血栓栓塞性肺動脈高壓病變組織中差異表達(dá)的基因，從多基因角度研究疾病發(fā)生的分子機(jī)制。方法 選取5例慢性血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈內(nèi)膜組織作為實(shí)驗(yàn)組，并選擇年齡和性別相匹配的5例肺移植供體的正常肺動脈內(nèi)膜組織為對照組。分別提取、純化RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，與Affymetrix 2.0 ST基因芯片進(jìn)行體外雜交，通過掃描信號及數(shù)據(jù)處理，分析出CTEPH肺動脈內(nèi)膜的差異基因表達(dá)譜，并選擇部分基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）驗(yàn)證。結(jié)果 通過對兩組基因表達(dá)譜比較分析，篩選出有統(tǒng)計學(xué)差異的1614個基因。其中880個基因表達(dá)上調(diào)，734個基因表達(dá)下調(diào)。篩選出差異最顯著的5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因，RT-PCR驗(yàn)證TBX15、FMO3、ITIH3、CHRDL1、ACADL表達(dá)與芯片結(jié)果符合。結(jié)論 慢性血栓栓塞性肺動脈高壓存在顯著的差異基因表達(dá)譜，篩選出來的差異基因涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、血栓形成、平滑肌增殖、血管生成等，而完整的基因功能信息、傳導(dǎo)通路、信號網(wǎng)絡(luò)等，尚需進(jìn)一步研究。

肺栓塞； 肺動脈高壓； 基因表達(dá)譜

慢性血栓栓塞性肺動脈高壓（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）是臨床上常見的潛在致命性疾病，在所有心血管疾病中發(fā)病率僅次于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和高血壓[1]。近段肺動脈內(nèi)存在機(jī)化或新鮮血栓及內(nèi)膜增生是CTEPH的典型特征。疾病診斷時往往已處于終末期，此時肺動脈壓（pulmonary artery pressure，PAP）和肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）已較正常值增高了5～10倍，導(dǎo)致肺動脈高壓和進(jìn)行性右心功能衰竭，終末發(fā)展為全心衰[2]。

肺動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)（pulmonary endarterectomy，PEA）是目前治療CTEPH最重要的手段之一，也是唯一的根治手段[3]。術(shù)后大約50%的患者血流動力學(xué)能恢復(fù)到正常水平。然而，15%～20%的患者術(shù)后PAP和PVR卻持續(xù)升高，導(dǎo)致圍術(shù)期死亡率增加了4%～5%[4]。某些因素如C反應(yīng)蛋白、血栓素A2、內(nèi)皮素-1、vW因子可能參與到肺動脈高壓的病理生理過程[5]。然而，由于存在數(shù)量較多的具有不同功能的基因位點(diǎn)，難以徹底闡明其發(fā)病機(jī)制。

20世紀(jì)90年代以來，商用化的基因芯片技術(shù)使得探究疾病本質(zhì)成為了可能。而新一代高通量基因表達(dá)譜芯片的出現(xiàn)，使得我們能快速全面分析CTEPH的基因表達(dá)。在本研究中，我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析CTEPH和對照組基因表達(dá)譜，篩選出顯著差異表達(dá)的基因。根據(jù)不同患者的遺傳特征來制訂更加個性化的診治方案，此項(xiàng)研究成果會對此起到積極作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年6～12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心外科的5例CTEPH患者，術(shù)前均行肺通氣與灌注斷層掃描、右心導(dǎo)管肺動脈造影檢查并已確診。CTEPH診斷標(biāo)準(zhǔn)是患者經(jīng)過至少6個月有效抗凝后仍存在勞力性呼吸困難，平均PAP＞25mm Hg（1mm Hg=0.133kPa）。肺通氣及灌注掃描可提示肺部節(jié)段或更大面積的病變。CTEPH的最終確診依賴右心導(dǎo)管肺動脈造影[6]。5例CTEPH患者均在我院實(shí)施肺動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)。實(shí)驗(yàn)組為PEA手術(shù)所取的5例病變肺動脈內(nèi)膜組織，其中男性2例、女性3例，平均年齡（38.2±14.7）歲。對照組是年齡和性別相匹配的5例肺移植供體的正常肺動脈內(nèi)膜組織，其中男性3例、女性2例，平均年齡（35.3±10.6）歲。手術(shù)取材后即刻將組織置入液氮罐，轉(zhuǎn)移儲存于-80℃超低溫冰箱，備總RNA提取。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書后開展。

1.2 方法

1.2.1 芯片制備 實(shí)驗(yàn)選用美國Affymetrix公司新一代的Human Gene 2.0 ST全轉(zhuǎn)錄組芯片，全面覆蓋轉(zhuǎn)錄組，可以同時檢測＞30 000個編碼的轉(zhuǎn)錄本和＞11 000個長鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本；探針設(shè)計最大程度覆蓋所有外顯子，可檢測選擇性拼接/轉(zhuǎn)錄本變體。每個轉(zhuǎn)錄本覆蓋特異探針的數(shù)目中值達(dá)到21種，每種探針的長度為25 bp。

1.2.2 總RNA提取與質(zhì)檢 實(shí)驗(yàn)組和對照組標(biāo)本用冷凍機(jī)粉碎，采用 TRIzol試劑（加拿大Invitrogen）提取，RNeasy Mini Kit（德國Qiagen）純化，并利用脫氧核糖核酸酶將DNA酶解，完成總RNA抽提。采用Nano Drop 2000分光光度計，測定不同波長吸光度，利用260 nm與280 nm的吸光度比值A(chǔ)260/A280（1.9～2.1）評估總RNA的濃度和純度。用1.5%甲醛變性凝膠電泳（電壓120 V）15 min，在凝膠成像儀下檢測總RNA中28 S和18 S的完整性。

1.2.3 RNA反轉(zhuǎn)錄與體外轉(zhuǎn)錄 在PCR儀反轉(zhuǎn)錄依次合成First-cDNA的第一鏈和第二鏈，之后通過體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，純化除去雜質(zhì)。以cRNA為模板，利用隨機(jī)引物和含有dUTP適合濃度的dTTP進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成2nd-cDNA，去除cRNA模板，純化后備用。

1.2.4 樣品標(biāo)記與芯片雜交 吸取片段化混懸液到樣本2nd-cDNA中，混勻，離心，在PCR儀中孵育反應(yīng)，得到片段化產(chǎn)物。采用2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測片段化cDNA片段大小，本實(shí)驗(yàn)范圍控制在100 bp以下。利用TdT標(biāo)記試劑將片段化cDNA標(biāo)記，標(biāo)記后的片段cDNA與Human Gene 2.0 ST芯片雜交，在Affymetri雜交爐（GeneChip2 Hybridzation Oven640）中，溫度45℃，轉(zhuǎn)速60 r/min條件下雜交16 h。

1.2.5 芯片洗滌和掃描 雜交完成后，吸除雜交液，在Affymetrix GeneChip Command Console中掃描注冊樣品信息。在Affymetrix洗脫站（GeneChip2 Fluidics Station 450）完成芯片洗滌、染色；采用Affymetrix掃描儀（GeneChip2 Scanner 3000 7G）進(jìn)行芯片掃描生成數(shù)據(jù)。利用RMA方法使原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，得到的芯片標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)用Affymetrix公司的表達(dá)控制軟件（版本1.2.1）進(jìn)行分析。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）實(shí)時熒光定量技術(shù)，在顯著差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取表達(dá)差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）較為顯著的5個基因，設(shè)計相應(yīng)的PCR引物，以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行RT-PCR予以驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計。用±s表示正態(tài)分布計量資料，比較采用獨(dú)立樣本配對t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（M）及四分位數(shù)（P25，P75）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)檢結(jié)果 提取的總RNA在1.5%甲醛變性凝膠電泳檢測，28 S和18 S核糖體RNA條帶亮而濃，28 S∶18 S條帶亮度比值接近2∶1；260 nm與280 nm波長的吸光度比值A(chǔ)260/A280在1.9～2.1范圍內(nèi)，總RNA純度和完整性符合基因芯片實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 基因篩選結(jié)果 根據(jù)基因芯片雜交結(jié)果分析，對比實(shí)驗(yàn)組和對照組，發(fā)現(xiàn)1614個基因有統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組880個基因表達(dá)上調(diào)，734個基因表達(dá)下調(diào)。差異倍數(shù)即兩組基因高表達(dá)量與低表達(dá)量的比值。表達(dá)上調(diào)時，F(xiàn)C取正值，反之取負(fù)值。取P＜0.05、FC＞3為篩選條件，得到了上調(diào)基因和下調(diào)基因各5個，具有最重要的統(tǒng)計學(xué)差異。見表1、2。

表1 重要的表達(dá)上調(diào)基因

表2 重要的表達(dá)下調(diào)基因

2.3 聚類分析（hierarchical clustering） 將實(shí)驗(yàn)組和對照組篩出的有統(tǒng)計學(xué)意義的1614個差異基因用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，圖1為分析后的聚類熱圖。1614個差異基因進(jìn)行聚類后，5例實(shí)驗(yàn)組樣本聚類在一起，5例對照組樣本聚類在一起，總體正確聚類效率100%。

2.4 部分差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 選取不同差異表達(dá)水平的 5個基因，其中表達(dá)上調(diào)基因 3個（TBX15、FMO3、ITIH3），表達(dá)下調(diào)基因 2個(CHRDL1、ACADL)，應(yīng)用RT-PCR檢測基因表達(dá)水平?；蛐酒蚏T-PCR檢測的基因差異表達(dá)結(jié)果一致，RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果見圖2。

3 討論

CTEPH是急性肺栓塞后血栓因種種原因未完全溶解而持續(xù)存在，通過機(jī)化、纖維化、重構(gòu)而導(dǎo)致肺血管阻塞。目前認(rèn)為CTEPH的病因存在血栓形成、溶栓異常、炎癥刺激三方面機(jī)制[7]。既往許多研究顯示，慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的發(fā)生受多種因素影響，其病理生理學(xué)過程仍未完全闡明。為此，國內(nèi)外相繼開展了一些更深層次的研究：細(xì)胞學(xué)特征、染色體核型分析、熒光原位雜交、單核苷酸多態(tài)性、基因表達(dá)譜等。通過基因芯片技術(shù)，有助于發(fā)現(xiàn)影響CTEPH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因。

近年來，基因表達(dá)譜芯片（cDNA microarrays）因其高通量、所需樣本量少、快速、敏感、自動化等特點(diǎn)，越來越多地被用于尋找新的疾病相關(guān)基因和關(guān)鍵性調(diào)控基因。通過將大量的寡核苷酸或cDNA片段高密度排列于特定載體上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理與樣本雜交后，用熒光檢測系統(tǒng)掃描、檢測，獲得大量有價值的基因信息。通過生物學(xué)信息對各基因的表達(dá)進(jìn)行比較和統(tǒng)計分析，確定不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性，分析基因功能、傳導(dǎo)通路、信號網(wǎng)絡(luò)，為探究疾病機(jī)制提供線索。

通過基因芯片技術(shù)已發(fā)現(xiàn)了一些與慢性血栓栓塞性肺動脈高壓可能相關(guān)的基因表達(dá)變化。Gu等[8]利用基因芯片篩選出了CTEPH的第1個表達(dá)上調(diào)的差異基因：氧化型低密度脂蛋白受體1（oxidized low density lipoprotein，OLR1），被發(fā)現(xiàn)與血管粥樣硬化等心血管疾病相關(guān)。最近，Wynants等[5]發(fā)現(xiàn)，OLR1在CTEPH中也有高表達(dá)。Lindner等[9]篩選出了CTEPH第2個表達(dá)上調(diào)的基因：白介素8（interleukin 8，IL8），被發(fā)現(xiàn)與PEA手術(shù)后血流動力學(xué)不穩(wěn)定相關(guān)。第3個被發(fā)現(xiàn)的重要表達(dá)上調(diào)基因是分泌型焦磷酸蛋白1（secreted phosphoprotein 1，SPP1），促使組織分泌骨鈣素。有研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)CTEPH表達(dá)下調(diào)的基因，都與腫瘤發(fā)生、炎癥趨化因子、脂類代謝等相關(guān)。如下調(diào)基因趨化因子配體14［chemokine（C-X-C motif）ligand 14，CXCL14］，促進(jìn)產(chǎn)生炎癥趨化因子[10]。另外一個下調(diào)基因乙酰肝素酶2（heparanase 2，HPSE2），編碼與Urofacial綜合征（UFS）相關(guān)的代謝酶類[11]。然而，上述OLR1、IL8、SPP1、CXCL14、HPSE2等基因在本研究中未顯著表達(dá)，考慮可能受疾病相關(guān)基因的多態(tài)性、個體差異、標(biāo)本數(shù)量等影響。

本研究選用了Affymetrix Human Gene 2.0 ST芯片是新一代全轉(zhuǎn)錄組基因芯片，敏感度高，全面覆蓋轉(zhuǎn)錄組。通過檢測CTEPH病變肺動脈內(nèi)膜和對照組正常肺動脈內(nèi)膜的基因表達(dá)譜，比較分析后得到了1614個有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)基因，其中880個基因上調(diào)，734個基因下調(diào)。設(shè)定P＜0.05、FC＞3，篩選出了最重要的5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因。

上調(diào)基因中的環(huán)氧化酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）促進(jìn)前列腺素的合成和釋放，在細(xì)胞分裂、舒張血管、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。含黃素單氧化酶 3（flavin containing monooxygenase 3，F(xiàn)MO3）能編碼一種關(guān)鍵的肝微粒體酶，參與體內(nèi)大量藥物、外源性物質(zhì)和其他一些化學(xué)物質(zhì)的氧化代謝。Nakamaru等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MO3和細(xì)胞色素P450酶（CYP3A4）協(xié)同參與膽固醇、類固醇、脂類的合成代謝，與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。而另一個重要的上調(diào)基因α胰蛋白酶抑制劑重鏈3（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3，ITIH3）有研究證實(shí)在心肌梗死、易栓癥患者中高表達(dá)，提示與血小板、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集，動脈粥樣斑塊病變相關(guān)[13]。

下調(diào)基因中差異倍數(shù)最顯著的基因，脊索生成素樣蛋白1（chordin-like protein 1，CHRDL1），編碼類脊索蛋白1，能拮抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4。Kane等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧的視網(wǎng)膜周細(xì)胞中CHRDL1高表達(dá)，抑制BMP4，同時分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成。第2個重要下調(diào)基因，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（FRAS1 related extracellular matrix 1，F(xiàn)REM1）則與跨膜通透、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)?；蜷L鏈?；o酶A脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase，long chain，ACADL）通過編碼酰基輔酶A脫氫酶調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化、能量代謝等，ACADL表達(dá)異常與缺氧時能量產(chǎn)生障礙相關(guān)[15]。顯著下調(diào)的基因神經(jīng)細(xì)胞黏附分子 1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM1）則與血管平滑肌收縮、細(xì)胞黏附聚集相關(guān)[16]。

慢性血栓栓塞性肺動脈高壓的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的多階段過程，與多基因表達(dá)異常相關(guān)。通過此項(xiàng)研究，我們初步篩查出差異表達(dá)的基因，結(jié)合其生物學(xué)信息，涵蓋了多個生物學(xué)過程，主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附、血栓形成、平滑肌增殖、血管生成等相關(guān)。

高通量基因表達(dá)譜芯片有助于快速篩查出致病基因及其編碼產(chǎn)物，從本質(zhì)揭示疾病的產(chǎn)生機(jī)制和發(fā)展過程。但此研究亦有一定的局限性，入組樣本量小、標(biāo)本取自病變肺動脈的不同位置（Jamieson分型不同）、個體差異等勢必會產(chǎn)生一定假陽性，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，同時需結(jié)合CTEPH的Jamieson病理分型，以期得到更準(zhǔn)確的CTEPH基因?qū)W分型。后續(xù)還需進(jìn)一步開展差異基因的功能信息、傳導(dǎo)通路、信號網(wǎng)絡(luò)等研究，為實(shí)現(xiàn)CTEPH的個體化診療提供理論依據(jù)。

圖1 差異基因檢測結(jié)果聚類熱圖。實(shí)驗(yàn)組（Experimental Group，Exp）和對照組（Control Group，Con）。橫坐標(biāo)代表分組的樣本，縱坐標(biāo)代表差異基因。基因表達(dá)水平用色度表示，紅色表示基因表達(dá)水平高，綠色則低。

圖2 部分差異表達(dá)基因的RT-PCR驗(yàn)證

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Study of the differential gene expression profiles in chronic thromboembolic pulmonary hypertension

LI Guang-hui，LIU Yan，SU Pi-xiong，et al.Department of Cardiac Surgery，Beijing Chaoyang Hospital，Capital Medical University，Beijing 100020，China

GU Song，E-mail：zhaogu@sina.com

Objective To investigate the differential gene expression profiles in chronic thromboembolic pulmonary hypertension and discuss the pathogenesis by cDNA microarray.MethodsAffymetrix Human Gene 2.0 ST microarray was used to examine the gene expression profiles of pulmonary artery endothelial cells from 5 CTEPH patients and 5 healthy controls from donors of lung transplants and matches to the patients with CTEPH. Total RNA was isolated and purified，reverse transcribed to cDNA.cDNA was hybridized to microarrays.The differential expressed genes were identified to RT-PCR analysis.ResultsCompared to normal samples，1614 genes with statistically changes in expression were identified.Of these，880 genes were upregulated in CTEPH group and 734 were downregulated.Five genes that were the most significantly upregulated or downregulated according to the P-value and fold change.RT-PCR results of TBX15，F(xiàn)MO3，ITIH3，CHRDL1，ACADL were consistent with gene chip analysis.ConclusionThe differential expressed genes in CTEPH most involved in inflammation，disturbed thrombolysis，enhanced thrombosis，cell adhesion，smooth muscle proliferation，angiogenesis.However，further studies are requied to identify GO analysis，pathway and signal-net.

Pulmonary embolism； Pulmonary hypertension； Gene expression profiles

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計劃（項(xiàng)目編號：2011-3-017）

100020 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心外科

顧松，E-mail：zhaogu@sina.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.04.022

R654.2

A

1672-5301（2016）04-0370-05

2015-12-11）