廖立敏,鄒　寧,黃　茜,李建鳳

(1.“果類廢棄物資源化”四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641100;2.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川內(nèi)江 641100)

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響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取血橙皮多糖工藝

廖立敏1,2,鄒寧2,黃茜2,李建鳳1,2

(1.“果類廢棄物資源化”四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川內(nèi)江 641100;2.內(nèi)江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,四川內(nèi)江 641100)

采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波提取血橙皮中的粗多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,通過對(duì)各影響因素的分析得到最優(yōu)提取工藝,即超聲波功率為320 W、液固比為30 mL/g,提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為30 min,此時(shí)多糖得率可達(dá)24.7%,實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,工藝穩(wěn)定可行,對(duì)于開發(fā)利用血橙皮渣中的多糖類物質(zhì)具有一定的參考價(jià)值。

血橙,多糖,超聲波提取,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

血橙(blood orange)是橙的變種,俗稱紅橙。血橙首次出現(xiàn)在1850年的歐洲,主要被種植在西班牙、意大利和北美。在中國,血橙主要分布在四川內(nèi)江資中縣、廣東平遠(yuǎn)縣,內(nèi)江資中縣被稱為“塔羅科血橙之鄉(xiāng)”。每年在血橙成熟的季節(jié),四川內(nèi)江一些果汁企業(yè)將大量的榨汁后的血橙皮渣拋棄于環(huán)境,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

柑橘類果皮渣中含有豐富的精油[1]、多糖[2]、果膠[3],此外還含有苦素[4]、色素[5]、黃酮[6]、橙皮苷[7-9]等諸多有效成分。對(duì)于血橙皮渣的研究主要集中在花色苷[10]、香氣成分[11]、黃酮類化合物[12]等方面,而對(duì)血橙皮中多糖類物質(zhì)的研究甚少。植物多糖具有抗氧化和防癌、抗過敏、降血壓等多種生理功效,可開發(fā)成功能食品、藥品、保健品、化妝品等產(chǎn)品。

已有采用溶劑浸提法[13]、超聲波法[14]、微波法[15]、酶法[16]等提取植物多糖的研究。溶劑浸提耗時(shí)長、產(chǎn)率低;微波法提取時(shí)間短,但提取過程反應(yīng)劇烈,熱不穩(wěn)定物質(zhì)極易在提取過程中遭到破壞,并且微波的泄露也會(huì)對(duì)操作者造成極大的傷害;酶法提取條件溫和、得率高,但對(duì)提取溫度較為敏感;超聲波提取具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取。本文采用超聲波法對(duì)血橙皮中的多糖類物質(zhì)進(jìn)行了提取研究,以期得到穩(wěn)定可行的提取工藝,為大量開發(fā)利用血橙皮渣提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

無水乙醇,石油醚,α-萘酚,苯酚,濃硫酸,葡萄糖等均為分析純;血橙購于四川省內(nèi)江市卓爾超市,產(chǎn)自四川內(nèi)江。

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TJ270-30紅外分光光度計(jì)天津市光學(xué)儀器廠;DFT-100手提式高速粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司;烘箱;CP2202S電子分析天平賽特利斯(北京)有限公司;離心沉淀器江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海申賢恒溫設(shè)備廠;恒溫水浴鍋。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝優(yōu)化主要考察液固比、超聲波功率、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。首先以液固比30 mL/g、超聲波功率240 W、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min為基礎(chǔ),在固定其中3個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下,改變其中1個(gè)實(shí)驗(yàn)因素,按提取方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選定其中3個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化,在確定的最佳條件附近進(jìn)一步設(shè)計(jì)選點(diǎn),應(yīng)用Design Expert 7.0.0軟件中的Box-Behnken安排實(shí)驗(yàn),因素及水平見表1。

表1　因素及水平

血橙皮多糖的提取:市售血橙,取皮,自然晾干(或60 ℃下烘干),粉碎,取40～60目血橙皮粉末,以體積大于等于固體體積2倍的石油醚回流2 h以脫去脂肪,抽濾,風(fēng)干備用。取5 g血橙皮粉,加入一定體積的去離子水,于一定的功率和溫度下超聲波提取一定時(shí)間,離心,上清液減壓濃縮至一定體積后加入95%乙醇至乙醇最終濃度為60%(v/v)以上,室溫下醇沉24 h,過濾,60 ℃下烘干得多糖粗品。

多糖的測(cè)定及得率計(jì)算:采用苯酚-硫酸法[17-18]。精密移取0.148 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,加蒸餾稀釋至2.0 mL,加5%苯酚溶液1 mL,迅速加入濃硫酸5 mL,搖勻,靜置20 min冷卻至室溫,以蒸餾水為空白,在波長為490 nm處測(cè)定吸光度,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=1.005X-0.1208,R2=0.99272。準(zhǔn)確稱取少量多糖粗品,加水溶解并顯色后測(cè)定吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。多糖得率(%)=(多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100。

1.2.2多糖的鑒定α-萘酚實(shí)驗(yàn)(Molish實(shí)驗(yàn))[19]:在試管中加入0.5 mL 5%多糖粗品溶液,滴入2滴10%α-萘酚的乙醇溶液,混合均勻后把試管傾斜45°,沿著試管壁慢慢加入1 mL濃硫酸(勿搖動(dòng)),觀察結(jié)果。

紫外光譜及紅外光譜:將少許所得多糖粗品以蒸餾水為溶劑配制成1 mg/mL的溶液,在190～400 nm波長下掃描,得紫外吸收?qǐng)D譜;少許多糖粗品用KBr壓片后在400～4000 cm-1之間用紅外光譜儀掃描,得紅外吸收?qǐng)D譜。

2　結(jié)果與討論

2.1多糖提取工藝的優(yōu)化

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1液固比對(duì)得率的影響多糖實(shí)際得率隨液固比變化情況見圖1,從圖可以看出起初提取溶劑體積的增加使得多糖的實(shí)際得率迅速上升,液固比為20 mL/g時(shí),多糖的實(shí)際得率接近最大值。液固比太小,細(xì)胞內(nèi)外濃度差不大,多糖不易溶出。液固比過大可能導(dǎo)致其他物質(zhì)也過多溶出,從而影響多糖的溶出。另外液固比太大,增加了后續(xù)濃縮操作的困難,浪費(fèi)能源。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以基本確定最佳液料比為20 mL/g左右。

圖1　液固比對(duì)提取的影響Fig.1　Effect of liquid solid ratio on extraction

2.1.1.2超聲波功率對(duì)得率的影響多糖實(shí)際得率隨超聲波功率變化情況見圖2,超聲波作為提取能量,功率越大物料在單位時(shí)間內(nèi)接受的超聲波輻射量越大,越有利于提取。但是當(dāng)在一定的功率下,多糖擴(kuò)散已經(jīng)達(dá)到平衡,繼續(xù)增大功率,得率也不會(huì)明顯增大。從圖可以看出起初超聲波功率的增大使得多糖的實(shí)際得率迅速上升,當(dāng)超聲波功率達(dá)到240 W時(shí)多糖的實(shí)際得率接近最大。另外超聲波功率太大,對(duì)周圍環(huán)境造成影響,還會(huì)造成能源浪費(fèi)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以基本確定最佳超聲波功率為320 W左右。

圖2　超聲波功率對(duì)提取的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on extraction

2.1.1.3提取溫度對(duì)得率的影響多糖實(shí)際得率隨提取溫度變化情況見圖3,溫度影響分子運(yùn)動(dòng)速率,浸提溫度低,多糖水化溶出不完全,提取速率慢;溫度高可以加快分子運(yùn)動(dòng),加速多糖從植物組織內(nèi)部向溶劑中擴(kuò)散,適當(dāng)提高提取溫度對(duì)提取是有利的;但是浸提溫度過高不利于實(shí)驗(yàn)操作,而且還可能會(huì)使多糖降解,影響多糖得率,增大能耗。從圖可以看出在低溫區(qū)多糖得率隨溫度的升高而增大,當(dāng)超過70 ℃后繼續(xù)升高溫度多糖實(shí)際得率沒有明顯變化,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以基本確定最佳提取溫度為70 ℃左右。

圖3　提取溫度對(duì)提取的影響Fig.3　Effect of temperature on extraction

2.1.1.4提取時(shí)間對(duì)得率的影響多糖實(shí)際得率隨提取時(shí)間變化情況見圖4,多糖由植物組織內(nèi)部擴(kuò)散到溶劑中需要一定的時(shí)間,當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡即使繼續(xù)延長時(shí)間多糖得率也不會(huì)增大。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,時(shí)間太長,多糖得率沒有明顯增加,但由于時(shí)間長,植物組織溶脹厲害,反而影響后續(xù)離心操作;另外,時(shí)間長也可能導(dǎo)致部分多糖被溶脹的植物組織吸附,從而降低多糖的實(shí)際得率;從節(jié)約時(shí)間、降低能耗方面講,在保證一定的多糖得率的情況下,提取時(shí)間應(yīng)該盡可能短。從圖可以看出提取時(shí)間為20 min時(shí)多糖實(shí)際得率接近最大,基本確定最佳提取時(shí)間為20 min左右。

表3　回歸模型方差分析

注:p<0.001,高度顯著;0.0010.1,不顯著。

圖4　提取時(shí)間對(duì)提取的影響Fig.4　Effect of extraction time on extractio

2.1.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)由于使用的超聲波發(fā)生器的功率只有4檔可調(diào),因此在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中將其功率固定為320 W,考察其它三個(gè)影響因素,以進(jìn)一步優(yōu)化。共設(shè)立了17個(gè)處理組(共5組全“0”水平處理組,用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差),具體實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

用Design Expert 7.0.0 軟件將表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到以得率為因變量Y,液固比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)為自變量X的二次多項(xiàng)式回歸模型:得率=17.5500+0.08025×A-0.3010×B+0.78775×C+1.2500×10-3×AB+2.0000×10-3×AC-4.2500E×10-3×BC+1.1500×10-3×A2+2.4000×10-3×B2-8.3500×10-3×C2。對(duì)所建立的響應(yīng)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可知,實(shí)驗(yàn)選用的模型高度顯著;相關(guān)系數(shù)R=0.986,說明該模型擬合程度良好,實(shí)驗(yàn)誤差較小,可以用此模型來分析以水為溶劑采用超聲波對(duì)血橙皮渣多糖的提取。

表4　各因素系數(shù)估計(jì)

回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知,模型一次項(xiàng)A高度顯著(p<0.001)、C高度顯著(p<0.001),B較顯著(p<0.1);二次項(xiàng)C2高度顯著、交互項(xiàng)BC較顯著,其他不顯著。所選擇的考察因素A和B對(duì)多糖得率有高度顯著的影響,因素C也有較顯著的影響,因此選擇這些因素進(jìn)行考察和優(yōu)化是合理的。

模型的各變量的系數(shù)估計(jì)值見表4,另外對(duì)各變量的膨脹因子VIF[20]進(jìn)行了計(jì)算,VIF的定義式為:VIF=(1-r2)-1,式中r為某自變量與其它變量的相關(guān)程度(判斷標(biāo)準(zhǔn):VIF值大于5.0,變量間共線性嚴(yán)重,相關(guān)方程不可靠),如診斷發(fā)現(xiàn)模型某變量VIF值過大,則繼續(xù)減少變量建模。從表4中可以發(fā)現(xiàn),各變量的膨脹因子VIF值中最大的才1.01,說明各變量間基本上不存在共線性,模型是有效的。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,圖5、圖6和圖7為液固比(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)在其中一個(gè)固定時(shí),另外兩個(gè)對(duì)多糖得率的交互影響曲面圖。

圖5　液固比、提取溫度及其交互作用Fig.5　Liquid-solid ratio,temperatureand their interaction

圖6　液固比、提取時(shí)間及其交互作用Fig.6　Liquid-solid ratio,timeand their interaction

圖7　提取溫度、提取時(shí)間及其交互作用Fig.7　Temperature,time and their interaction

圖8　預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)圖Fig.8　Calculated vs. experimental value

比較圖5、圖6和圖7的曲面圖可知,液固比(A)和提取時(shí)間(C)對(duì)多糖得率的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,而提取溫度(B)次之,表現(xiàn)為曲線相對(duì)平滑?？赡苁嵌嗵窃诳疾斓臏囟确秶鷥?nèi)溶出速度都較大,故提取溫度(B)的變化對(duì)多糖得率影響不是特別顯著。比較圖5、圖6和圖7的等高線圖可以看出液固比(A)與提取溫度(B)的交互影響、液固比(A)與提取時(shí)間(C)的交互影響不顯著,表現(xiàn)為等高線走向趨于一致并有共圓心的趨勢(shì)。而提取溫度(B)與提取時(shí)間(C)的交互影響顯著,表現(xiàn)為等高線走向不一致并不具有共圓心的趨勢(shì),結(jié)果與方差分析相似。

上述模型對(duì)各處理?xiàng)l件下的多糖得率的預(yù)測(cè)值列于表2,為便于觀察將模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)繪于圖8,誤差分布繪于圖9。從圖8可以發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)樣本點(diǎn)都落在斜率為1的對(duì)角線附近,說明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值接近。圖9可以看出各實(shí)驗(yàn)條件下多糖的模型預(yù)測(cè)誤差都處在±0.5范圍以內(nèi),說明模型預(yù)測(cè)誤差小?？偟膩碚f,模型能較好地預(yù)測(cè)各實(shí)驗(yàn)條件下多糖的得率,該模型可以用于對(duì)血橙皮多糖的超聲波提取工藝分析和參數(shù)優(yōu)化。

圖9　誤差分布Fig.9　Error distribution

通過對(duì)多糖得率的回歸模型進(jìn)行二次多項(xiàng)試數(shù)學(xué)解逆矩陣以及相關(guān)數(shù)學(xué)分析,得到液固比(A)為30 mL/g、提取溫度(C)為60 ℃、提取時(shí)間(D)為30 min時(shí),多糖得率可以取得最大值24.1%。將超聲功率設(shè)定為320 W、液固比為30 mL/g、提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為30 min,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,得多糖得率分別為25.2%、24.3%和24.5%,平均值為24.7%。三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)多糖平均得率24.7%,與模型預(yù)測(cè)值24.1%接近,多糖得率高、質(zhì)量好,本研究所得血橙皮多糖超聲波提取最優(yōu)條件是正確可靠的。

2.2多糖的鑒定

最佳提取條件下所得多糖粗品為灰白色、絮狀、松散、易碎的固體,見圖10。取少許粗品進(jìn)行α-萘酚實(shí)驗(yàn)(Molish實(shí)驗(yàn)),實(shí)驗(yàn)中觀察到硫酸在下層,試液在上層,在兩層交界處出現(xiàn)紫色環(huán),表示溶液含有糖類化合物。多糖粗品的紫外光譜及紅外光譜如圖11、圖12所示。由圖11可見,在260 nm和280～290 nm處無紫外吸收,表明多糖粗品中不含蛋白質(zhì)、多肽及核酸。但在220 nm附近有強(qiáng)的吸收,表明含有糖類物質(zhì)。

圖10　血橙皮多糖粗品外貌Fig.10　Appearance of blood orangepeel polysaccharide products

圖11　血橙皮多糖紫外光譜Fig.11　UV spectrum of blood orange peel polysaccharide

圖12　血橙皮多糖紅外光譜Fig.12　Infrared spectral of blood orange peel polysaccharide

在圖12中,3420 cm-1為O-H伸縮振動(dòng)吸收峰,2937 cm-1為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰,1610 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰,1485～1445 cm-1為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰,1110 cm-1為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰,以上均為糖類化合物的特征吸收,同樣表明樣品中主要為多糖類物質(zhì)。

3　結(jié)論

本文采用超聲波對(duì)血橙皮中的多糖進(jìn)行了提取研究,對(duì)影響多糖得率的各因素進(jìn)行了討論,得到了超聲波提取血橙皮多糖的最佳提取工藝參數(shù),即超聲波功率為320 W、液固比為30 mL/g,提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為30 min,此時(shí)多糖得率可達(dá)24.7%,實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好。通過Molish實(shí)驗(yàn)、紫外光譜及紅外光譜對(duì)提取所得多糖粗品進(jìn)行了檢驗(yàn),結(jié)果表明多糖粗品中主要為多糖類物質(zhì),不含蛋白質(zhì)、多肽及核酸。本研究對(duì)于開發(fā)利用血橙皮中的多糖類物質(zhì)具有一定的參考價(jià)值。

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Optimization of ultrasonic extraction technology of blood orange peel polysaccharide by response surface

LIAO Li-min1,2,ZOU Ning2,HUANG Xi2,LI Jian-feng1,2

(1.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling of Sichuan Provincial College,Neijiang 641100,China;2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Neijiang Normal University,Neijiang 641100,China)

The process of ultrasonic extraction of polysaccharide from blood orange peel was optimized by response surface tests. The optimum ultrasonic extraction conditions were obtained through the analysis of each factor:ultrasonic power was 320 W,liquid-solid ratio was 30 mL·g-1,extraction temperature was 60 ℃ and extraction time was 20 min. With this process,the relatively higher yields of polysaccharide reached 24.7%. The reproducibility of the experiments was good and the extraction process was stable and feasible. This study showed a certain reference value for the development and utilization of polysaccharide from blood orange peel residues.

blood orange;polysaccharide;ultrasonic extraction;response surface tests

2015-11-19

廖立敏(1981-)，男，碩士，副教授，研究方向：果類廢棄物資源化研究工作，E-mail：liaolimin523@126.com。

四川省教育廳青年基金項(xiàng)目(13ZB0003)。

TS224.2

B

1002-0306(2016)11-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.035