楊京霞,李　靜,吳　婷,張自備,石亞男,黃銀生

(1.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽阜陽 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽 236037;3.阜陽師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，安徽阜陽 236037)

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太和香椿水提物對秀麗隱桿線蟲生物學(xué)特征的影響及清除自由基作用的研究

楊京霞1,2,李靜1,吳婷1,張自備1,石亞男1,黃銀生3,*

(1.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽阜陽 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽 236037;3.阜陽師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，安徽阜陽 236037)

目的:探討太和香椿水提物對秀麗隱桿線蟲生物學(xué)特征的影響,并研究水提物清除線蟲體內(nèi)自由基的作用。方法:用太和香椿水提物配制三種不同濃度的NGM培養(yǎng)基,檢測每組線蟲體長,壽命,體內(nèi)氧自由基含量以及一分鐘活動(dòng)次數(shù),分析太和香椿水提物對線蟲生物學(xué)特征及抗氧化作用的影響。結(jié)果:濃度為0.5 mg/mL香椿水提物的實(shí)驗(yàn)組中線蟲的平均體長、壽命、一分鐘活動(dòng)次數(shù)和體內(nèi)氧自由基的含量與空白對照組相比,差異均極顯著(p<0.01);表明該濃度下太和香椿水提物能夠促進(jìn)線蟲的生長,并具有明顯的清除自由基作用。

秀麗隱桿線蟲,太和香椿水提物,延緩衰老

香椿是一種古老的菜用樹種,除了可食用外,它還具有清熱解毒、健胃理氣、潤膚明目等功效[1-2]。近代中醫(yī)多以樹皮、根皮入藥,具有驅(qū)風(fēng)祛濕、收斂止血、抗菌止痛等功效[3],多用于治療肺咳、便血、菌痢、腸炎、崩漏等癥。近年來人們對香椿藥學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究,使得香椿的藥用及保健價(jià)值越來越被人們所認(rèn)識(shí),促進(jìn)了香椿資源的更深層次的開發(fā)。安徽省太和縣栽種香椿的歷史悠久,且品質(zhì)較高,唐代時(shí)曾用此物作為貢品,清朝時(shí)被御封為“貢椿”[4]。秀麗隱桿線蟲生命周期較短為2～3周,是國際上研究衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn)的典型模式生物[5-6]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的對太和香椿藥用價(jià)值的研究較少,而關(guān)于香椿藥用活性成分的研究主要集中在香椿總黃酮物質(zhì)、酚類物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)上,對香椿水提物中的具體成分目前并未有研究。本實(shí)驗(yàn)以太和香椿為材料,研究其水提物對秀麗隱桿線蟲體長、一分鐘活動(dòng)次數(shù)、體內(nèi)氧自由基含量和壽命等指標(biāo),考察太和香椿在延緩衰老方面的作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

N2野生型秀麗隱桿線蟲及大腸桿菌OP50中科院等離子體物理研究所吳李君研究員惠贈(zèng);太和香椿安徽省太和縣;5-Fu尿嘧啶，DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)美國Sigma公司;M9緩沖液(1 L水中加入3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl和1 mL 1 mol/L的MgSO4);PBS緩沖液ThermoFisher公司;NaN3上海誠稟生物科技有限公司。

DM1000倒置熒光顯微鏡德國徠卡;RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;HVE-50高壓滅菌鍋日本Hirayama公司;ZSD-A1270生化培養(yǎng)箱上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1太和香椿水提物的制備將購買的太和香椿曬干后粉碎,準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的粉末5.0000 g,加去離子水400 mL,60 ℃水浴加熱1 h,取濾液。濾渣加水后再提取一次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,最后定容至50 mL,得0.1 g/mL的香椿水提物,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2NGM(Nematode Growth Medium,線蟲生長培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的配制線蟲的培養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)的NGM培養(yǎng)基,具體的配制方法參照文獻(xiàn)[7],三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別用移液槍加入0.1、1、10 mL上述香椿水提物,121 ℃滅菌30 min,得到分別含有0.05、0.5、5 mg/mL不同濃度香椿水提物的實(shí)驗(yàn)組NGM培養(yǎng)基200 mL。

1.2.3線蟲同步化用200 μL的M9緩沖液沖洗線蟲,3000 r/min,離心1 min,去上清,然后加入裂解液1 mL于EP管中,靜置10 min后,5000 r/min,離心1 min,最后用M9緩沖液沖洗3次,3000 r/min,離心1 min后,取下層,置于25 ℃下孵化12 h得L1幼蟲,將L1幼蟲轉(zhuǎn)移到已培養(yǎng)好OP50的實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的NGM培養(yǎng)基中;25 ℃培養(yǎng)30 h,得L4期成蟲[8]。

1.2.4線蟲壽命的測定挑選L4期的線蟲15只[9],轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)組NGM培養(yǎng)基中,各培養(yǎng)基中均加入12.5 mg/L 5-Fu尿嘧啶以抑制子代線蟲孵育[10]。每天記錄線蟲生存狀況和存活個(gè)數(shù),轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)第0 d,全部線蟲死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.5線蟲體長的測定在線蟲長到L4期后的第2 d,從每組中隨機(jī)挑取5只線蟲,經(jīng)NaN3麻醉后放在顯微鏡下拍照,對其長度進(jìn)行測量。

1.2.6線蟲體內(nèi)氧自由基含量的測定在線蟲長到L4期后的第2 d,每組挑取5只線蟲用熒光試劑盒染色[11-13](DCFH-DA),在倒置熒光顯微鏡下拍照,并用ipp圖像分析軟件分析照片中線蟲熒光光密度,熒光光密度越強(qiáng)說明其體內(nèi)氧自由基含量越多。

1.2.7線蟲一分鐘活動(dòng)次數(shù)的測定每組分別隨機(jī)挑取15只線蟲置于含過量M9的培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下觀察并記錄其每分鐘活動(dòng)次數(shù)。

1.2.8數(shù)據(jù)處理分析將不同濃度條件下得到的各組數(shù)據(jù)即線蟲壽命、體長、線蟲一分鐘活動(dòng)次數(shù)和線蟲體內(nèi)熒光光密度等數(shù)據(jù)進(jìn)行X檢驗(yàn),計(jì)算結(jié)果由p值來表示顯著性差異,如果p值小于0.05表示差異顯著,p值小于0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度太和香椿水提物對線蟲壽命的影響

從表1中可以看出,香椿水提物可以延長線蟲的壽命,但并不與濃度呈正相關(guān),當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),與其他三組差異極顯著p<0.001,線蟲平均壽命最長為(8.06±1.01)d,平均壽命指每組中各線蟲實(shí)際壽命的平均值[14],說明該濃度的太和香椿水提物可以顯著的延長線蟲壽命,對于研究衰老具有積極意義。

表1　不同濃度香椿水提液對線蟲壽命的影響

表2　不同濃度香椿水提物對線蟲體長(μm)的影響

2.2不同濃度太和香椿水提物對線蟲體長的影響結(jié)果

從圖1、表2中可以看出,0.05 mg/mL組和5 mg/mL組對線蟲體長的增長效果并不明顯,而0.5 mg/mL組效果極顯著(p<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,濃度過低或者過高對線蟲的生長促進(jìn)作用并不明顯,原因可能是濃度低時(shí)不能有效的促進(jìn)線蟲的生長,濃度高時(shí)可能抑制了線蟲的生長,只有濃度適中時(shí)才能顯著促進(jìn)線蟲的生長,使線蟲體長明顯增加。

圖1　不同濃度香椿水提物對線蟲體長的影響Fig.1　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the body length of nematodes

2.3不同濃度太和香椿水提物對線蟲體內(nèi)氧自由基的影響

氧自由基具有強(qiáng)氧化性,可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞,進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針[15-16],DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH可以迅速被自由基氧化成為具高熒光的物質(zhì)—DCF。其氧化過程生成的DCF量與自由基的含量成正比,通過圖像分析軟件可以分析出檢測DCF的熒光光密度以判定細(xì)胞內(nèi)氧自由基的水平。圖2為線蟲光密度的熒光染色照片。

對四組線蟲平均熒光光密度進(jìn)行分析顯示,0.5 mg/mL組與其他三組差異極顯著(p<0.01),0.05 mg/mL組與0.5 mg/mL組差異顯著(p<0.05)。通過對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)熒光光密度的分析,熒光光密度越低,氧自由基含量越低,可見太和香椿水提物可以清除線蟲體內(nèi)氧自由基的含量。關(guān)于衰老的自由基學(xué)說早已被廣大研究學(xué)者接受和認(rèn)同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.5 mg/mL香椿水提物的熒光光密度與空白組相比具有顯著的清除自由基的功能,而早在1955年,Dr. Harman發(fā)表的 “衰老的自由基理論”就提出,體內(nèi)產(chǎn)生過多自由基是引起衰老的重要因素[17],這一理論也得到科研工作者的廣泛認(rèn)同。本實(shí)驗(yàn)中香椿水提物能夠有效的清除線蟲體內(nèi)的氧自由基,因此香椿水提物是一種很好的抗氧化劑,在延緩衰老方面有著積極的作用。

表3　不同濃度香椿水提物對線蟲熒光光密度的影響

圖2　不同濃度香椿水提物對線蟲熒光光密度的影響Fig.2　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the fluorescence optical density of nematodes

2.4不同濃度太和香椿水提物對線蟲一分鐘活動(dòng)次數(shù)的影響

對四組線蟲每分鐘平均活動(dòng)次數(shù)進(jìn)行分析得到0.5 mg/mL組與其他三組差異極顯著(p<0.01)。說明0.5 mg/mL的太和香椿水提物可以增強(qiáng)線蟲的活動(dòng)能力,明顯促進(jìn)線蟲的每分鐘活動(dòng)次數(shù),對線蟲的生長有積極作用。

表4　不同濃度香椿水提物對線蟲活動(dòng)次數(shù)(次/min)的影響

3　結(jié)論與討論

本文中關(guān)于香椿水提物的濃度參考查閱了相關(guān)文獻(xiàn),文獻(xiàn)對于香椿提取物的研究濃度多集中在0.01～10 mg/mL的范圍內(nèi)。臺(tái)灣學(xué)者對香椿萃取物進(jìn)行研究,體外實(shí)驗(yàn)顯示,香椿葉、樹皮和根皮的萃取物在濃度為0.625 mg/mL時(shí)香椿清除DPPH自由基能力達(dá)80%[18]。故本實(shí)驗(yàn)研究的低中高三個(gè)濃度定為0.05、0.5和5 mg/mL,通過一系列實(shí)驗(yàn)研究表明,濃度過低或者過高都不適于線蟲的生長,當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)各個(gè)生物學(xué)特征的指標(biāo)最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示太和香椿水提物可以促進(jìn)線蟲的生長,在抗氧化和延緩衰老方面有著積極作用。但對于水提物的具體成分還有待于進(jìn)一步分析研究。

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Effects of Taihe Cedar aqueous extract onC.Elegansbigoloical characteristics and scavenging free radicals

YANG Jing-xia1,2,LI Jing1,WU Ting1,ZHANG Zi-bei1,SHI Ya-nan1,HUANG Yin-sheng3,*

(1.College of biological and food engineering,Fuyang normal college，F(xiàn)uyang 236037,China;2.Anti-aging Chinese herbal medicine in anhui province engineering technology research center，F(xiàn)uyang 236037,China;3.College of physics and electronic engineering,Fuyang Normal College，F(xiàn)uyang 236037,China)

Objective:To study the influence of Taihe Cedar aqueous extract on Caenorhabditis elegans(C.Elegans)biological characteristics and the scavenging free radicals ability in the body of the water extract clear nematodes. Methods:The length,life span,activity and content of oxygen free radicals of nematodes which cutlured by NGM culture medium with three different concentration of the Taihe cedar aqueous extract were measured to investigated the effect of Taihe Cedar aqueous extract on the biological characteristics and the antioxidant ability of nematodes.Results:Compared with control,significant differences were observed on the average length,longevity,activity times per minute and the content of oxygen free radicals of nematodes cultured with concentration of 0.5 mg/mL cedar aqueous extract(p<0.01).The experimental results showed that the concentration of Taihe Cedar water extract could promote the growth ofC.Elegans,and possess obvious effect of scavenging free radicals.

C.Elegans;Cedar aqueous extract;anti-aging

2015-07-13

楊京霞(1982-),女,碩士,講師,主要從事中草藥成分及活性研究,E-mai:yangjingxia1228@126.com。

黃銀生(1978-),男,碩士,講師,主要從事計(jì)算物理和生物物理學(xué),E-mai:81313140@qq.com。

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A872);安徽省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng)目(2014KJ009);安徽高?？蒲衅脚_(tái)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目;安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(AH201310371051,201510371059,20151062,20151068);阜陽師范學(xué)院校級自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2013FSKJ17)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)11-0328-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.059