王　榕,宮　莉,姚　斌,薛鮮麗,羅會穎,張永杰,蘇小運,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所,北京 100081)

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利用RNAi抑制cre1基因轉(zhuǎn)錄提高里氏木霉表達纖維素酶

王榕1,2,宮莉2,姚斌2,薛鮮麗2,羅會穎2,張永杰1,*,蘇小運2,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所,北京 100081)

本研究采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)對里氏木霉主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子cre1基因的表達進行抑制,以期提高里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力。通過PCR,從里氏木霉的基因組中擴增得到cbh1啟動子、反向的cre1基因片段(568～963 bp)、正向的cre1基因片段(655～961 bp)和cbh2終止子,利用DNA assembler方法將這些基因連接到pRS424質(zhì)粒上,構(gòu)建成pCre1-i質(zhì)粒。再將RNAi盒分作兩個片段擴增,同時轉(zhuǎn)化里氏木霉并通過PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵顯示其中一株轉(zhuǎn)化子在纖維素誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)4.5 d后,其纖維素酶的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活和CBHI酶活為0.67、3.70和0.46 U/mL,較出發(fā)菌株分別提高了1.3、1.8和5.6倍。通過實時熒光RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化子中cre1基因的轉(zhuǎn)錄水平比出發(fā)菌株降低了43%。

cre1,RNAi,纖維素酶,DNA assembler

纖維素酶作為自然界中數(shù)量最大的可再生資源,在制酒、醬油釀造、飲料加工等食品行業(yè)有廣泛的應用價值[1]。目前,報道的主要產(chǎn)纖維素酶的菌株多為真菌[2]。其中,里氏木霉因其表達能力強(工業(yè)上,經(jīng)改造后的里氏木霉,其產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量可達到100 g/L以上[3])、易于培養(yǎng)和符合“一般公認安全”等優(yōu)點,在工業(yè)表達酶基因、尤其是纖維素酶上得到了極大的應用。里氏木霉的纖維素酶系包括兩個外切纖維素酶、五個內(nèi)切纖維素酶、一個β-葡萄糖苷酶和六個裂解性多糖單加氧酶[4-5]。

cre1是里氏木霉的一個廣域的轉(zhuǎn)錄抑制因子,能調(diào)節(jié)大部分纖維素酶甚至半纖維素酶基因的表達[6]。在里氏木霉主要的纖維素酶和木聚糖酶基因上,都或多或少的存在著cre1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點[7]。雖然cre1的主要作用是轉(zhuǎn)錄抑制因子,但完全敲除cre1基因,在以微晶纖維素做唯一碳源進行誘導時,產(chǎn)酶水平低于野生型菌株的最大產(chǎn)酶水平,意味著cre1還具有一定的轉(zhuǎn)錄激活作用[8]。因此,對cre1基因的調(diào)控,不能簡單的采取基因敲除的策略,而應該采取抑制其表達的策略。RNA干擾(RNAi)技術(shù)提供了一種快速、有效抑制目的基因表達的方法[9]。受到RNAi的受體菌株,其被調(diào)控基因呈現(xiàn)從高到低的一系列表達水平,與基因敲除在性狀上呈現(xiàn)有或無不同,其具有連續(xù)性。

本研究采取RNAi技術(shù)對cre1基因進行干擾調(diào)節(jié),期望能提高受體菌株產(chǎn)纖維素酶的水平,為利用RNAi技術(shù)對里氏木霉進行遺傳改造構(gòu)建高效表達的菌株提供新的思路,同時為纖維素酶在食品領域的廣泛應用提供可能性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

里氏木霉QM9414(ATCC 26921)和Tu6ΔtKU70(ATCC MYA-256,尿嘧啶缺陷菌株)[10]均由中國科學院微生物研究所董志揚教授饋贈。pEASY-T3質(zhì)粒購于全式金;質(zhì)粒pRS424為本實驗室保存,用作質(zhì)粒骨架構(gòu)建。pCre1-i重組質(zhì)粒(pRS424-armL-cbh1p-cre1f-cre1r-cbh1t-pyrG-armR,圖1)由本實驗室構(gòu)建。

里氏木霉生長培養(yǎng)基:(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO415.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,CaCl2·2H2O 0.6 g/L,CoCl2·6H2O 0.0037 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L,MnSO4·H2O 0.0016 g/L,葡萄糖20 g/L,自然pH。

里氏木霉纖維素誘導培養(yǎng)基:(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO415.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,CaCl2·2H2O 0.6 g/L,CoCl2·6H2O 0.0037 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,ZnSO4·7H2O 0.0014 g/L,MnSO4·H2O 0.0016 g/L,微晶纖維素Avicel(購自Sigma公司)20 g/L,自然pH。

色氨酸(Trp)缺陷型培養(yǎng)基:YNB 6.7 g/L,葡萄糖 20 g/L,Trp Do supplement(購自Clontech)0.64 g/L,瓊脂粉 20 g/L。

T100TM普通PCR儀、CFX-96實時熒光定量PCR儀和212PRO凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;CR22GШ立式高速冷凍離心機購自日本HITACHI公司;移液槍購自德國Eppendorf公司;CT6E臺式高速冷凍離心機購自日本HITACHI公司;SPECORD200PLUS紫外分光光度計購自德國耶拿分析儀器公司;H1MFDG酶標儀購自美國BioTek儀器有限公司;SPX-250生化培養(yǎng)箱購自北京利康達圣科技術(shù)發(fā)展有限公司;ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1pCre1-i質(zhì)粒的構(gòu)建以里氏木霉QM9414基因組為模板,利用引物ParmL(SR)F1/R1、PpyrG(SR)F1/R1、ParmR(SR)F1/R1(表1)擴增獲得armL、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)和armR。armL和armR片段分別作為在里氏木霉里進行同源重組的左臂和右臂,pyrG基因作為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的篩選標記基因。并同時引進NotI和EcoR I酶切位點。利用引物Pcbh1P(SR)F1/R1、Pcre1(SR)F1/R1、Pcre1(SR)F2/R2、Pcbh2t(SR)F1/R1,擴增獲得cbh1啟動子、反向的cre1基因(cre1r)568～963 bp片段、正向的cre1基因(cre1f)655～961bp片段以及cbh2終止子并同時引入KpnI和EcoR I酶切位點。將pRS424質(zhì)粒用EcoR I酶切,電泳、回收線性化質(zhì)粒載體。將其與armL、pyrG、armR按1∶3∶3∶3的摩爾比用氯化鋰法共同轉(zhuǎn)化釀酒酵母AH109的感受態(tài)細胞,采用DNA assembler方法進行拼接[11]。DNA assembler利用釀酒酵母的高效同源重組機制,能快速的將多個具有相同核苷酸末端(重疊區(qū)長度需要大于30 bp)的DNA片段在體內(nèi)一次性和線性化的質(zhì)粒拼接起來。同樣的方法將EcoRI酶切的pRS424質(zhì)粒與cbh1啟動子、反向的cre1基因、cbh2終止子DNA片段,共轉(zhuǎn)化釀酒酵母AH109的感受態(tài)細胞,涂布在色氨酸(Trp)缺陷型培養(yǎng)基上,30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。對酵母菌落做菌落PCR,以鑒定是否已經(jīng)成功構(gòu)建pRS424-armL-pyrG-armR和pRS424-cbh1p-cre1f-cbh2t重組質(zhì)粒。將PCR鑒定為陽性的酵母菌落挑取并接種于3 mL YPD培養(yǎng)基上,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細胞(全式金,北京),涂布于含100 μ g/mL氨芐的LB瓊脂平板上,37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落,接種于3 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐)中,37 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒。

隨后,用KpnI和EcoRI雙酶切pRS424-cbh1p-cre1r-cbh2t,同時將用PCR擴增所得到的正向的cre1基因用KpnI和EcoR I雙酶切,將回收質(zhì)粒和正向的cre1基因用T4連接酶(TaKaRa公司)連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細胞,篩選重組質(zhì)粒pRS424-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t(圖1)。利用引物Pcbh1P(SR)F3/Pcbh2t(SR)R3從重組質(zhì)粒pRS424-cbh1p-cre1反-cre1正-cbh2t上擴增獲得cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t片段。

最后,將pRS424-armL-pyrG-armR重組質(zhì)粒用EcoR I酶切,與上一步獲得的cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t片段用DNA assembler法進行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。經(jīng)驗證正確后,最終將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1感受態(tài)細胞,提取重組質(zhì)粒pCre1-i(圖1)。

表1　本研究所用引物

1.2.2里氏木霉的轉(zhuǎn)化用ParmLF2/PpyrGR2和Pcbh2tF2/ParmRR2(表1)引物對分別從重組質(zhì)粒pCre1-i上擴增armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段。在1%瓊脂糖膠上電泳,切下PCR產(chǎn)物中的目的條帶,純化DNA備用。

將里氏木霉TU6ΔtKU70接種于土豆培養(yǎng)基(PDA)平板上,30 ℃靜置培養(yǎng)7 d待其產(chǎn)孢,將孢子刮下并接種于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)過夜。在12層紗布上過濾收集萌發(fā)的菌絲,加入10 mg/mL的Lysing enzymes(購自Sigma公司),在30 ℃消化1～2 h。收集原生質(zhì)體,將armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段混合,以PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將兩種DNA同時轉(zhuǎn)入里氏木霉TU6ΔtKU70菌株。每微克DNA可獲得約10個轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子中同時含有兩種DNA的轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化效率為80%。

1.2.3重組轉(zhuǎn)化子的篩選轉(zhuǎn)化子在含1 mol/L山梨醇的MM-glucose瓊脂培養(yǎng)基上生長和選擇。7 d后,挑取單個克隆,接種于MM-glucose培養(yǎng)基上進行再次生長、選擇。挑取單克隆接種于PDA平板上,30 ℃培養(yǎng)5～6 d。取部分菌絲,用UniversAll-tissue extraction PCR kit(YEASTERN,Taipei,Taiwan)提取基因組DNA,通過PCR驗證cre1基因是否轉(zhuǎn)入以及兩片段是否發(fā)生重組并成功整合到里氏木霉基因組。PCR所用引物為Pcbh1P(SR)F1/YZ-pyrGR(表1)。

1.2.4轉(zhuǎn)化子的誘導培養(yǎng)將出發(fā)菌株TU6ΔtKU70的孢子和各轉(zhuǎn)化子的孢子,接種2.0 mL 1×107/mL的孢子于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)1 d。將菌絲用12層紗布過濾,收集菌絲并用大量無菌水沖洗,以去除殘余的葡萄糖。

稱取等量(900 mg)的菌絲,接種于100 mL MM-Avicel液體培養(yǎng)基中,出發(fā)菌株和每個轉(zhuǎn)化子均做3個平行。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)7 d以誘導纖維素酶的生產(chǎn)。從第3 d開始,每12 h收集發(fā)酵液,儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.5纖維素酶活測定纖維素酶濾紙酶活的測定:纖維素酶的濾紙酶活(FPase activity)采用Whatman一號濾紙,參照IUPAC標準方法進行測定。濾紙酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH4.8的條件下,每小時水解濾紙底物,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

外切纖維素酶活的測定:用4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside(MUC,Sigma)作底物,稱取45 mg MUC,溶于3 mL DMSO(Sigma),再將其轉(zhuǎn)移到42 mL檸檬酸緩沖液(pH5.2,20 mmol/L)中。將25 μL適當稀釋的酶液和250 μL MUC、25 μL葡萄糖(1 mol/L)混合,此為不加纖維二糖實驗組。在混合溶液中,葡萄糖會抑制BG降解MUC,因此,測得的活性實際為CBH1和EG的活性。同時設加纖維二糖實驗組:25 μL酶液和200 μL MUC、25μL(50 mmol/L)纖維二糖和葡萄糖于50 ℃反應10 min。加入纖維二糖會抑制CBH的活性,因此測得的是EG的活性,于50 ℃反應10 min。加入250μL Na2CO3(1 mmol/L),于370 nm測定吸光度。將不加纖維二糖實驗組OD值減去加纖維二糖實驗組,即為外切纖維素酶較為特異的活性。一單位的外切纖維素酶酶活定義為每秒催化1 nmol/L MUC水解所需要的酶量。

內(nèi)切纖維素酶酶活測定:采用1%羧甲基纖維素鈉(CMC)作為底物進行測定。取酶液62.5 μL,加入到175 μL磷酸—檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L、pH4.8)配制的CMC中,加水定容到250 μL。50 ℃,反應1 h,測定酶活力。CMC酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH4.8的條件下,每小時水解羧甲基纖維素鈉,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

β-葡萄糖苷酶酶活的測定:用pNP-Glucose(pNPG)為底物,取0.24 g pNPG用蒸餾水定容到50 mL,得到16 mmol/L的pNPG為底物。使用前-20 ℃避光保存。取50 μL已稀釋的酶液,加入15.625 μL pNPG和125.5 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)用水定容到250 μL,pNPG終濃度為1 mmol/L,振蕩混勻。50 ℃水浴保溫1 h,迅速冷卻向各試管中加入750 μL Na2CO3試劑,再向空白中補加50 μL酶液,混合均勻。以0號管為參比,測定540 nm的吸光度。β-葡萄糖苷酶酶活的單位定義為:1 mL液體酶,在50 ℃、pH5.0的條件下,每小時水解pNPG,產(chǎn)生1 mg還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

對出發(fā)菌株TU6ΔtKU70和轉(zhuǎn)化子,經(jīng)預實驗測定酶活,發(fā)現(xiàn)在4.5 d時纖維素酶的酶活最高。因此,選取4.5 d的發(fā)酵液,分別測定總體纖維素酶酶活(濾紙酶酶活)及各分解酶酶活包括內(nèi)切纖維素酶酶活(CMC酶活)、外切纖維素酶CBHI的酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活(BG酶活)。

1.2.6cre1的轉(zhuǎn)錄豐度測定出發(fā)菌株與重組菌株先接種2.0 mL 1×107/mL的孢子于100 mL MM-glucose培養(yǎng)基中。30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)1 d。稱取等量濕重(900 mg)的菌絲,接種于100 mL MM-纖維素液體培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振搖培養(yǎng)2 d以誘導纖維素酶的生產(chǎn)。收集誘導后第2 d的菌絲,在濾紙上壓干菌絲,進行研磨并提取總RNA。將所提取總RNA用ReverTra Ace-α-試劑盒(TOYOBO,日本)處理,將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設計引物,以actin 基因作為內(nèi)參,q-cre1F/q-cre1R為引物(表1),1 μg cDNA為模板,按TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金.北京)試劑盒進行操作,比較轉(zhuǎn)化子和對照株中cre1轉(zhuǎn)錄物的相對豐度。

1.3數(shù)據(jù)處理方法

所有結(jié)果均釆用Excel和SPSS16.0版統(tǒng)計軟件中One-Way ANOVA過程進行方差及其顯著性分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1pCre1-i質(zhì)粒構(gòu)建及重組子的鑒定

按1.2.1的方法,構(gòu)建了pCre1-i質(zhì)粒(圖1),并通過Not I酶切驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功(圖3A)。通過ParmLF2/PpyrGR2和Pcbh2tF2/ParmR2(表1)引物對從重組質(zhì)粒pCre1-i擴增獲armL-cbh1p-cre1r-cre1f-cbh2t-pyrG和cbh1t-pyrG-armR片段,將兩個片段共轉(zhuǎn)化里氏木霉TU6ΔtKU70(圖2)。所采用的宿主菌為ku70基因敲除株,并且用于轉(zhuǎn)化的兩個片段間設計了1 kb的重疊片段,因此,預期兩個片段可以重組在一起,并在左、右重組臂(armL和armR)的介導下,整合到里氏木霉基因組的ku70座位上。cbh1啟動子驅(qū)動含反、正cre1基因片段的轉(zhuǎn)錄,mRNA在細胞內(nèi)形成發(fā)夾狀RNA并在Dicer的作用下形成小分子RNA并最終使降解目的基因cre1的mRNA降解(圖2)。設計一對引物Pcbh1P(SR)F1和YZ-pyrGR(表1),PCR驗證是否armL-cbh1p-cre1反-cre1正-cbh2t-pyrG和cbh2t-pyrG-armR片段已成功整合(圖3B)。從圖3B可以看出,六個轉(zhuǎn)化子均有3 kb左右的特異擴增條帶,與預期條帶大小一致,而以出發(fā)菌株做模板則沒有此條帶,說明兩個DNA片段已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入里氏木霉TU6ΔtKU70并整合在一起。

圖1　pCre1-i質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1　The diagram for pCre1-i plasmid construction

圖2　通過RNAi抑制里氏木霉cre1的表達示意圖Fig.2　The schematic diagram of inhibiting cre1 expression by RNAi

圖3　PCR鑒定目的片段是否插入里氏木霉基因組Fig.3　Identification of positive Trichoderma reesei transformantswith the target fragment by PCR注:A:pCre1-i質(zhì)粒酶切驗證。M:DNA分子量標準;1:未酶切pCre1-i質(zhì)粒;2:Not I酶切后的pCre1-i質(zhì)粒。B:PCR驗證RNAi片段重組入里氏木霉基因組。M:DNA分子量標準;1:出發(fā)菌株TU6ΔtKU70;2-7:各轉(zhuǎn)化子。

2.2纖維素酶活測定

經(jīng)預實驗,從6個轉(zhuǎn)化子中選擇一株酶活最高的2號轉(zhuǎn)化子進行詳細的纖維素酶酶活測定。分別以濾紙、CMC、MUC和pNPG為底物測定出發(fā)菌株和2號轉(zhuǎn)化子的總體纖維素酶酶活、內(nèi)切纖維素酶酶活、外切纖維素酶CBHI酶活以及β-葡萄糖苷酶的酶活。從圖4可看出,2號轉(zhuǎn)化子的總體纖維素酶活是TU6ΔtKU70的1.3倍,說明轉(zhuǎn)化子較出發(fā)菌株,其纖維素酶酶活有顯著提高。與出發(fā)菌株相比,該轉(zhuǎn)化子的內(nèi)切纖維素酶活性提高極為顯著,為出發(fā)菌株的1.8倍(圖4)。外切纖維素酶CBHI活性也有一定程度的提高,2號轉(zhuǎn)化子的CBHI酶活是出發(fā)菌株的5.6倍(圖4)。但對β-葡萄糖苷酶而言,轉(zhuǎn)化子的酶活與TU6ΔtKU70相比下降了65%(圖4)。

圖4　轉(zhuǎn)化子2與出發(fā)菌株TU6ΔtKU70酶活比較Fig.4　Comparison of enzyme activities of Transformant No. 2 with those of the parent strain TU6ΔtKU70

2.3cre1的表達差異研究

將出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)化子取等量濕重菌絲,用MM-纖維素培養(yǎng)基30 ℃誘導表達。提取48 h的RNA并反轉(zhuǎn)獲得cDNA,通過熒光定量PCR(q-PCR),以actin基因為內(nèi)參,對cre1轉(zhuǎn)錄水平進行監(jiān)測。熒光定量 PCR 結(jié)束后,通過 IQ5 軟件自動分析得出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值,采用2-ΔΔCT方法,比較轉(zhuǎn)化子和對照株中cre1基因的相對轉(zhuǎn)錄豐度。結(jié)果顯示,與TU6ΔtKU70相比,轉(zhuǎn)化子cre1表達量下降了43%(圖5)。這說明正如預期的一樣,cre1的表達得到了一定程度的抑制,從而提高了里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力。

圖5　出發(fā)菌株TU6ΔtKU70與轉(zhuǎn)化子2中cre1的轉(zhuǎn)錄豐度比較Fig.5　Comparison of the transcript abundance of cre1 between the parent strain TU6ΔtKU70and Transformant No. 2注:A:cre1和看家基因actin的擴增曲線。B:cre1的轉(zhuǎn)錄豐度比較。

3　結(jié)論與討論

據(jù)報道,目前已經(jīng)有30多種絲狀真菌中可以應用RNA干擾技術(shù)[12],這種技術(shù)對于某些重要的管家基因的功能研究來講是一種很理想的工具,在里氏木霉里也曾經(jīng)得到過成功應用。例如,將cbh1基因的表達進行RNAi的抑制,可以提高外源基因黑曲霉脂酶在里氏木霉里的分泌表達[13]。通過RNAi,成功將cre1基因的表達進行下調(diào),證明RNAi可用于對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。相應的,與出發(fā)菌株相比,2號轉(zhuǎn)化子的總體纖維素、內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶的酶活均有明顯的提高,將有利于纖維素酶在食品工業(yè)更為廣泛和深入的應用。其中,CBHI的活性提高了5.6倍。有意思的是,β-葡萄糖苷酶的活性下降了。里氏木霉的β-葡萄糖苷酶活性來自于bgl1基因,和cbh1啟動子有4個功能性的cre1結(jié)合位點不同,雖然bgl1啟動子上也有1個可能的cre1結(jié)合位點,但看起來bgl1的表達并不受cre1基因的調(diào)節(jié)抑制,這也許可以解釋在2號轉(zhuǎn)化子中,β-葡萄糖苷酶的活性的原因。

在構(gòu)建RNAi載體時,我們選用了DNA assembler的方法[11],在釀酒酵母AH109中,進行體內(nèi)重組以將各目的片段拼接起來。與常規(guī)依賴于限制性酶切和連接酶連接不同,它是利用同源重組的方法使具有同源末端的片段連接起來,能夠?qū)崿F(xiàn)同時對多個片段的連接,大大提高了構(gòu)建復雜、含多個基因片段載體的效率。另外,我們在構(gòu)建好質(zhì)粒載體pCre1-i后,通過PCR將cre1基因的RNAi盒以及兩側(cè)的同源重組臂分作兩個片段PCR擴增出來,并同時轉(zhuǎn)化里氏木霉,獲得了在里氏木霉細胞內(nèi)兩個片段重組在一起的菌株。因此,這還為以后將多個基因片段(如合成生物學研究中的代謝途徑中的多個基因)轉(zhuǎn)化入里氏木霉里并在其中進行同源重組打下了良好的基礎。

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Improving cellulase expression ofTrichodermareeseiby RNAi-mediated repression ofcre1 transcription

WANG Rong1,2,GONG Li2,YAO Bin2,XUE Xian-li2,LUO Hui-ying2,ZHANG Yong-jie1,*,SU Xiao-yun2,*

(1.School of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 03006,China;2.Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture,Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

The RNA interference(RNAi)technique was used to repress the expression of the main transcriptional repressorcre1 in order to improve the cellulase production ofTrichodermareesei. Thecbh1 promoter,a reversedcre1 gene fragment(568～963 bp),an ordinarycre1 gene fragment(655～961 bp),andcbh2 terminator were all amplified from the genomic DNA ofT.reeseiby polymerase chain reaction(PCR). The DNA assembler method was used to assemble all these gene fragments in pRS424 to obtain the pCre1-i plasmid. Two fragments encompassing the RNAi cassette were amplified from the plasmid and transformed simultaneously intoT.reesei. PCR was used to verify the positive colonies. In the flask batch culture,one of the transformants displayed 0.67、3.70 and 0.46 U/mL for the filter paper cellulase,endoglucanase,and CBHI activity,which were 1.3,1.8,and 5.6 folds of the parent strain. By using RT-qPCR,the transcript level ofcre1 in this transformant was determined to be lowered to 43% of that of the parent strain.

cre1;RNAi;cellulase;DNA assembler

2015-12-02

王榕(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:wangrong109@163.com。

蘇小運(1979-),男,博士,研究員,研究方向:絲狀真菌基因工程,E-mail:suxiaoyun@caas.cn。

張永杰(1979-),男,博士,教授,研究方向:微生物進化生物學與分子生態(tài)學,E-mail:zhangyj2008@sxu.edu.cn。

國家自然科學基金青年基金項目(31400067);中國農(nóng)業(yè)科學院青年英才計劃。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.031