張曉元,郝榮華,劉　飛,侯重文,朱希強

(山東省藥學科學院山東福瑞達醫(yī)藥集團公司 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東濟南 250101)

?

麥芽糖漿預處理對酶法生產海藻糖的影響研究

張曉元,郝榮華,劉飛,侯重文,朱希強*

(山東省藥學科學院山東福瑞達醫(yī)藥集團公司 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東濟南 250101)

利用酵母發(fā)酵法預處理去除麥芽糖漿中葡萄糖,以消除底物抑制提高酶法生產海藻糖產率。實驗以產朊假絲酵母為發(fā)酵微生物,以麥芽糖漿中的葡萄糖去除率為指標,采用單因素及正交實驗方法探討不同因素對葡萄糖去除率的影響,并確定最佳工藝參數(shù)。結果表明:麥芽糖漿體積分數(shù)40%,酵母菌液接種量4%,pH5.5,溫度32 ℃條件下,發(fā)酵 6 h后葡萄糖的去除率可達99.4%。以此糖漿為酶反應底物生產海藻糖,海藻糖產率由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達96.0%。研究結果對工業(yè)化利用麥芽糖漿酶法生產海藻糖提供有效數(shù)據(jù)及理論支持。

產朊假絲酵母,麥芽糖漿,預處理,海藻糖

海藻糖獲譽“生命之糖”,在脫水、干旱、低溫、高滲透等惡劣環(huán)境下可對生物膜、蛋白質和核酸等生物大分子進行有效保護,進而維持生物體的生命過程和生物特征[1-4]。而葡萄糖、蔗糖、乳糖等其它糖類均不具備這一功能。獨特的功能特性,使得海藻糖除廣泛用作酶類、疫苗和其他生物制品的活性保護劑外,更可作為甜味劑、穩(wěn)定劑、保鮮劑等應用于食品加工和儲存,以有效保持食品新鮮風味及避免食品品質劣化[5-9]。

目前,海藻糖生產大都采用一步酶轉化法,由tres基因編碼的海藻糖合酶通過分子轉糖基作用、異構反應將麥芽糖轉化為海藻糖[10-13]。工業(yè)化生產上多采用麥芽糖漿替代純麥芽糖粉,以降低生產成本,提高產品收益。麥芽糖漿主要成分為麥芽糖及少量葡萄糖、麥芽三糖、麥芽四糖,其中葡萄糖含量約5%～10%(以干物質計)[14-15]。生產中發(fā)現(xiàn)麥芽糖漿中過多葡萄糖成分會嚴重抑制海藻糖產率[16],因此對麥芽糖漿進行合適預處理來降低葡萄糖含量至關重要。Kyu Beomk等報道用模擬移動床分離色譜技術連續(xù)處理分離葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖[17]。但作為工業(yè)化生產原料預處理上應用,相對成本較高。酵母發(fā)酵法去除葡萄糖在木糖母液、玉米皮水解液、大豆低聚糖等生產上都有所報道,該法安全性高,價格低廉而廣受市場歡迎[18-20]。但在麥芽糖漿預處理應用上尚未見報道。本研究選用產朊假絲酵母發(fā)酵法去除麥芽糖漿中葡萄糖,優(yōu)化預處理工藝條件,以提高酶法生產海藻糖產率,為工業(yè)化生產提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

產朊假絲酵母YKY-Z81(CandidautilisYKY-Z81)本實驗室篩選保存的耐高糖酵母菌;麥芽糖漿(固形物(80%),麥芽糖(50%),葡萄糖(10%)保齡寶生物股份有限公司提供;海藻糖合酶(適用pH5.5～6.5 酶活單位100 U/mL)本實驗室構建基因工程菌株發(fā)酵獲得;其他生化試劑均分析純購自山東博尚生物科技有限公司。

生物傳感儀SBA-40C山東省科學院生物研究所;液相色譜儀1200型美國安捷倫公司;六聯(lián)發(fā)酵罐Infors ht 1000 mL瑞士INFORS公司。

1.2實驗方法

1.2.1產朊假絲酵母菌液制備將活化后產朊假絲酵母CandidautilisYKY-Z81按1%～2%的接種量無菌條件下接種到YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min恒溫培養(yǎng)至OD600=4～5,5000 r/min離心5 min,去除上清液,得到酵母泥。用前加入1/5發(fā)酵體積無菌水懸浮得酵母菌液,顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)酵母菌數(shù)量控制在1～1.2×109個/mL。

1.2.2葡萄糖含量測定方法生物傳感儀SBA-40C測定葡萄糖含量。

1.2.3海藻糖、麥芽糖測定方法參照文獻[21]HPLC法檢測,具體參數(shù)色譜柱:XBridgeTMNH2(3.5 μm×4.6 μm×250 mm);柱溫:35 ℃;流動相:V乙腈∶V水=4∶1,配好后加0.1%氨水;流速:1.0 mL/min;檢測器溫度:40 ℃。

1.2.4單因素實驗方法利用Infors ht 1000 mL六聯(lián)發(fā)酵罐模擬工業(yè)化生產,進行平行反應實驗。重點考察酵母菌液接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、麥芽糖漿體積分數(shù)這四個主要因素,確定各參數(shù)的較優(yōu)條件。六聯(lián)罐參數(shù)設計如下:統(tǒng)一最終裝液量70%(700 mL)、轉速200 r/min、進氣壓力0.05 MPa、通氣量0.2 L/min、DO不控制。發(fā)酵時間16 h,每2 h測定一次葡萄糖含量。

1.2.4.1酵母菌液接種量對去除葡萄糖效果的影響選用體積分數(shù)為50%的麥芽糖漿液,酵母菌液分別以1%、2%、3%、4%和5%的接種量,發(fā)酵溫度28 ℃,pH6.5,進行去除葡萄糖發(fā)酵并定時測定葡萄糖含量。

1.2.4.2發(fā)酵溫度對去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分數(shù)50%,酵母菌液接種量為3%,分別在26、28、30、32、34 ℃溫度下,pH6.5,進行去除葡萄糖發(fā)酵并定時測定葡萄糖含量。

1.2.4.3麥芽糖漿的pH對去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分數(shù)50%,酵母菌液接種量為3%,發(fā)酵溫度28 ℃,分別調節(jié)其pH為4.5、5.5、6.5、7.5,進行去除葡萄糖發(fā)酵并定時測定葡萄糖含量。

1.2.4.4麥芽糖漿體積分數(shù)對去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%,酵母菌液接種量為3%,發(fā)酵溫度28 ℃,pH6.5,進行去除葡萄糖發(fā)酵并定時測定葡萄糖含量。

1.2.5正交實驗設計在單因素實驗基礎上,采用正交表L9(34)做正交實驗(見表1)優(yōu)選實驗結果。每個處理重復3次,每次做3個平行。

表1　正交實驗因素與水平設計

1.2.6海藻糖酶法合成參照文獻[22]方法,(預處理)麥芽糖漿用0.02 mol/L pH6.5磷酸緩沖液稀釋成40%體積分數(shù)稀釋液,取95 mL稀釋麥芽糖漿底物加入5 mL海藻糖合酶酶液,24 ℃反應30 h后,沸水浴10 min終止酶反應,12000 r/min離心10 min,上清液適當稀釋后用HPLC測定生成的海藻糖量。

計算海藻糖產率(%)=反應液海藻糖量/反應液總糖含量×100

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

GraphPad Prism 6統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)并制圖。應用正交設計助手II V3.1軟件對正交實驗數(shù)據(jù)進行極差分析。

2　結果與討論

2.1酵母接種量對去除葡萄糖效果的影響

由圖1可知,在麥芽糖漿濃度和葡萄糖濃度等初始條件相同的情況下,葡萄糖去除效果與接種量呈正相關,接種量增加,葡萄糖去除速度增加。1%酵母菌液接種量去除葡萄糖速度最慢,發(fā)酵16 h,麥芽糖漿中仍有質量分數(shù)約0.3%葡萄糖存在。3%～5%酵母菌液接種量去除葡萄糖效果相差不大,發(fā)酵10 h時,葡萄糖質量分數(shù)可降低至0.3%左右,此后下降變緩,直至葡萄糖質量分數(shù)趨于零。因此可以得出,麥芽糖漿體積分數(shù)為50%時,接種3%酵母菌液,發(fā)酵10 h即可有效去除葡萄糖。

圖1　不同接種量下葡萄糖濃度隨時間的變化Fig.1　Effect of the addition of yeast on the result of removing glucose

2.2發(fā)酵溫度對去除葡萄糖效果的影響

由圖2可知,在26～32 ℃范圍內,隨著溫度升高,葡萄糖去除效果越明顯。主要原因在于,在一定溫度范圍內,隨溫度升高,酵母細胞內酶活性升高,生長繁殖加快,葡萄糖利用效率提高[23]。當溫度提高至34 ℃時,過高溫度影響菌體生長及菌體參與葡萄糖代謝相關酶活性[24]。因此選擇32 ℃下進行葡萄糖去除較為恰當。

圖2　不同溫度下葡萄糖濃度變化Fig.2　Effect of the temperature on the result of removing glucose

2.3麥芽糖漿的pH對去除葡萄糖效果的影響

由圖3可知,pH為7.5時,去除葡萄糖效果最差。pH為5.5和6.5時效果差別不大,去除葡萄糖效果較好。故麥芽糖漿的pH選為5.5～6.5。

圖3　pH對葡萄糖去除效果的影響Fig.3　Effect of the pH on the result of removing glucose

2.4麥芽糖漿體積分數(shù)對去除葡萄糖效果的影響

由圖4可知,麥芽糖漿體積分數(shù)越大,葡萄糖去除越慢。分析原因,麥芽糖漿濃度的增加對應葡萄糖濃度也增加,去除葡萄糖所需的時間也增長。另外,糖濃度的增加,酵母細胞周圍的滲透壓升高,影響酵母細胞生長及胞內營養(yǎng)物質的運輸。當麥芽糖漿體積分數(shù)增加至60%以上時,葡萄糖去除速度明顯變慢。麥芽糖漿體積分數(shù)30%、40%,葡萄糖濃度8 h內降至0.2%以下;麥芽糖漿體積分數(shù)50%時,葡萄糖濃度8 h內可降至0.7%以下。綜合考慮后續(xù)海藻糖工業(yè)化生產時麥芽糖底物濃度要求30%～40%,預處理后麥芽糖漿還需進行pH調節(jié)及添加酶液,麥芽糖濃度會進一步稀釋降低,故選擇40%～50%體積分數(shù)麥芽糖漿較為合適。

圖4　麥芽糖漿體積分數(shù)對葡萄糖去除效果的影響Fig.4　Effect of the concentration of malt syrup on the result of removing glucose

2.5正交實驗設計

在單因素實驗數(shù)據(jù)基礎上,結合海藻糖工業(yè)生產上下游工藝及節(jié)能降耗、簡化工藝目標,優(yōu)化設計水平參數(shù)見表1,其中麥芽糖漿pH對下游海藻糖合酶穩(wěn)定性影響較大,根據(jù)酶適用pH5.5～6.5范圍,選取5.5、6.0、6.5三水平?？刂祁A處理時間6 h,以葡萄糖殘留濃度為指標,進行四因素三水平的正交實驗確定最佳葡萄糖去除條件。

表2　L9(34)正交實驗結果與分析

按表2進行正交實驗,正交實驗的結果進行極差分析,得到各因素對實驗的影響的主要順序是D>A>B>C,A2B2C1D1為較優(yōu)方案,即酵母菌液接種量4%,發(fā)酵溫度32 ℃,pH5.5,麥芽糖漿添加比例40%。根據(jù)正交實驗結果做最佳因素的驗證實驗,麥芽糖漿預處理前后主要成分濃度變化見圖5,可見麥芽糖漿中葡萄糖濃度由初始2.47%降低0.053%以下,接近于零;麥芽糖及糖漿中麥芽三糖、麥芽四糖等其他雜糖成分基本沒有影響。

圖5　麥芽糖漿預處理前后主要成分濃度變化及對海藻糖合成影響Fig.5　Concentration changes of main componentsand effects on the yield of trehalose beforeand after malt syrup pretreatment注：顯著性差異p值p<0.05(*)；p<0.01(**)；p<0.001(***)。

2.6預處理麥芽糖漿對海藻糖酶法合成影響

分別以預處理前麥芽糖漿和預處理后麥芽糖漿為底物,利用海藻糖合酶進行麥芽糖轉化生產海藻糖。HPLC法檢測海藻糖產量,計算可知海藻糖生成率由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達96.0%(圖5)。

3　結論

通過實驗,得出麥芽糖漿預處理較佳條件為:麥芽糖漿體積分數(shù)40%,產朊假絲酵母菌液接種量4%,pH為5.5,溫度32 ℃條件下,經(jīng)6 h發(fā)酵預處理,糖漿中葡萄糖濃度可降低至0.06%以下。有效降低了葡萄糖作為麥芽糖異構生產海藻糖反應副產物的反饋抑制作用,海藻糖產率也由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達96.0%。該研究為工業(yè)化以麥芽糖漿為底物生產海藻糖提供了理論及數(shù)據(jù)支持。

[1]Colaco C,Kampinga J,Roser B. Amorphous stability and trehalose[J]. Science,1995,268(5212):788.

[2]Eleutherio E C,Araujo P S,Panek A D. Role of the trehalose carrier in dehydration resistance ofSaccharomycescerevisiae[J]. Biochim Biophys Acta,1993,1156(3):263-266.

[3]Wiemken A. Trehalose in yeast,stress protectant rather than reserve carbohydrate[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,1990,58(3):209-217.

[4]孫常文,李發(fā)財,龐明利,等. 海藻糖的特性分析及應用優(yōu)勢[J].發(fā)酵科技通訊,2013(3):37-41.

[5]靳文斌,李克文,胥九兵,等. 海藻糖的特性、功能及應用[J].精細與專用化學品,2015(1):30-33.

[6]王乃強,張艷君,薛雅鶯,等. 海藻糖的性質及應用[J].精細與專用化學品,2014(1):35-37.

[7]麥鋒,陸曉霞,汪振炯. 海藻糖對中式糯米糕團品質影響研究[J]. 糧食與飼料工業(yè),2014(3):22-25.

[8]荊曉艷,章銀良,張陸燕,等. 海藻糖涂膜保鮮草莓和辣椒的研究[J]. 河南工業(yè)大學學報：自然科學版,2014(2):

81-84.

[9]張曉燕,云雪艷,梁敏,等. 含有海藻糖的生物可降解薄膜對冷鮮肉的保鮮與護色作用[J]. 食品工業(yè)科技,2015(8):298-304.

[10]Wang T,Jia S,Dai K,et al. Cloning and expression of a trehalose synthase fromPseudomonasputidaKT2440 for the scale-up production of trehalose from maltose[J]. Can J Microbiol,2014,60(9):599-604.

[11]曲茂華,張鳳英,何名芳,等. 海藻糖生物合成及應用研究進展[J]. 食品工業(yè)科技,2014(16):358-362.

[12]謝定,張瓊,朱婧,等. 海藻糖生產方法及其合成酶研究進展[J]. 食品與機械,2013(2):223-226.

[13]Eastmond P J,Van Dijken A J,Spielman M,et al. Trehalose-6-phosphate synthase 1,which catalyses the first step in trehalose synthesis,is essential forArabidopsisembryomaturation[J]. Plant J,2002,29(2):225-235.

[14]展現(xiàn)明,王念祥,閆鎖,等. 真菌酶和β-淀粉酶在麥芽糖漿生產中的應用[J]. 湖南農業(yè)科學,2010(15):97-99.

[15]易翠平,蔡吉祥,劉瑞興. 大米淀粉制備麥芽糖漿的工藝研究[J]. 食品科學,2010(24):24-27.

[16]Pan Y T,Koroth E V,Jourdian W J,et al. Trehalose synthase ofMycobacteriumsmegmatis:purification,cloning,expression,and properties of the enzyme[J]. Eur J Biochem,2004,271(21):4259-4269.

[17]Kim K B,Kishihara S,Fujii S,et al. Simultaneously Continuous Separation of Glucose,Maltose,and Maltotriose Using a Simulated Moving-Bed Adsorber[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry,1992,56(5):801-802.

[18]李燁,曹龍奎. 酵母發(fā)酵法去除玉米皮水解液中葡萄糖的研究[J]. 農產品加工：學刊,2011(5):36-38.

[19]王秀娟,王成福,秦慶陽,等. 酵母發(fā)酵法去除木糖母液中葡萄糖的研究[J]. 中國食品添加劑,2010(2):115-118.

[20]王普,虞炳鈞. 木糖母液微生物脫除葡萄糖及回收木糖[J]. 食品科學,2002(7):73-76.

[21]趙偉,段瑩瑩,張曰輝,等. HPLC法檢測海藻糖的研究[J]. 中國釀造,2014(10):148-150.

[22]羅鋒,段緒果,宿玲恰,等.Thermobifidafusca海藻糖合成酶基因的克隆表達及發(fā)酵優(yōu)化[J]. 中國生物工程雜志,2013(8):93-99.

[23]何東東,張坤生. 產朊假絲酵母生長條件的優(yōu)化[J]. 食品科技,2010(2):14-17.

[24]Lansing M. Prescott. Microbiology[M]. 北京:高等教育出版社(影印版),2002:121-125.

Effect of malt syrup pretreatments on the trehalose production by enzymatic method

ZHANG Xiao-yuan,HAO Rong-hua,LIU Fei,HOU Zhong-wen,ZHU Xi-qiang*

(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences,Shandong Freda Pharmaceutical Group Company,Key Laboratory of Biopharmaceuticals,Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,Jinan 250101,China)

Removing the glucose from malt syrup could disarm the substrate inhibition and improve the trehalose production by enzymatic method. In this study,the removing efficiency of glucose from malt syrup was improved by yeast fermentation,and the fermentation parameters was optimized by mono-factor analysis and orthogonal test. Results showed that at the presence of 40% malt syrup,4% yeast,99.4% glucose could be removed from malt syrup after incubation for 6 hour at 32 ℃ pH5.5. As a consequence,the trehalose yield increased from 29.8% to 58.4% which was a 96.0% increase compared with that obtained before. Our results provide a promising strategy for industrial production of trehalose using malt syrup as substrate.

Candidautilis;malt syrup;pretreatment;trehalose

2015-11-19

張曉元(1979-)，男，碩士，高級工程師，研究方向：微生物技術，E-mail：gnice@163.com。

朱希強(1967-)，男，博士，研究員，研究方向：生物技術藥物，E-mail：xistrong@sina.com。

山東省自主創(chuàng)新成果轉化專項(2014GGZH1306)；濟南市重大專項(201403009)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)11-0161-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.025