鐘方麗,王文姣,2,王曉林,*,修洋洋

(1.吉林化工學院,化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林大學化學學院,吉林長春 130012)

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微波協(xié)同雙水相提取桔梗莖總黃酮及抗氧化活性研究

鐘方麗1,王文姣1,2,王曉林1,*,修洋洋1

(1.吉林化工學院,化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林大學化學學院,吉林長春 130012)

利用微波協(xié)同雙水相法研究了桔梗莖總黃酮的提取工藝及其體外抗氧化性。首先,采用單因素和正交設計法對提取工藝進行了優(yōu)化;其次,利用分光光度法研究了桔梗莖總黃酮提取液對DPPH·、·OH的清除活性。結果表明,當料液比為1∶40(m/v),微波功率為500 W,醇水比為0.8∶1,提取時間為5 min,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL時,桔梗莖總黃酮的提取得率較高,其平均得率為0.793%;桔梗莖總黃酮提取液對DPPH·、·OH具有較強的清除能力,且其清除活性隨桔梗莖總黃酮提取液質量濃度的增加而逐漸增強。

桔梗莖,雙水相,總黃酮,抗氧化

桔梗為桔?？浦参锝酃５母稍锔?為藥食同源的傳統(tǒng)中藥材,主要含有三萜皂苷、黃酮類等活性成分,吉林省是桔梗主產(chǎn)區(qū)之一[1]。桔梗的藥用、食用價值很高,市場需求量很大,桔梗傳統(tǒng)上以其根入藥,現(xiàn)代研究表明桔梗具有祛痰鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調節(jié)等眾多藥理活性[2-5]。桔梗莖與桔梗根相比資源豐富、廉價易得,但桔梗莖作為廢物多被丟棄,現(xiàn)有研究表明桔梗莖中含有大量的黃酮類活性成分,其提取物具有明顯的抗炎、祛痰等生理活性[6-7]。而目前關于桔梗莖總黃酮的研究開展較少,加強對桔梗莖的科學研究,可以變廢為寶,減少資源的浪費,提高藥農收益。黃酮類化合物具有增強人體免疫力、保肝、降血脂、抗衰老等多種生理活性[8],是一類前景廣闊的天然抗氧劑。黃酮類化合物通過清除自由基來實現(xiàn)它的抗氧化活性,評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性已成為研究保健食品、藥品的重要內容之一[9-11]。雙水相體系是一種具有工藝條件溫和等優(yōu)點的新型分離技術,已應用于天然產(chǎn)物中活性成分的分離[12-13]。本實驗采用微波協(xié)同雙水相法對桔梗莖中的黃酮類成分進行提取,并考察了其提取液清除DPPH·、·OH的活性,評價了其抗氧化能力,以期為合理利用桔梗莖提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桔梗莖吉林省均林中草藥種植有限公司;蘆丁成都曼思特生物科技有限公司;DPPH·上海如吉生物科技有限公司;鄰二氮菲天津市科密歐化學試劑有限公司;水為重蒸餾水;石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸銨天津市永大化學試劑有限公司;磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、正丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

TU-1810型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;MAS-Ⅱ型常壓微波輻射萃取儀上海新儀微波化學科技有限公司;FA2004N型電子天平上海精密科學儀器有限公司;KQ118型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9076A型電熱鼓風干燥器上海精密實驗設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品總黃酮含量測定精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品9.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加60%乙醇溶解,定容,搖勻,配制成質量濃度為0.18 mg/mL的對照品溶液,精密吸取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,置于25 mL容量瓶中,加5% NaNO2溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min,加10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min,加4% NaOH溶液4.0 mL,再加60%乙醇定容至刻度,搖勻,放置15 min。以相應的試劑為空白,按照分光光度法,在510 nm處測定其吸光度,以吸光度為縱坐標,質量濃度為橫坐標繪制標準曲線[14]。吸取桔梗莖總黃酮提取液適量,置于25 mL容量瓶中,按上述方法進行顯色,測定其吸光度,計算提取液中總黃酮的含量。

總黃酮含量(mg)={[(A-0.0023)/14.599]×25×25}/V

式中:A為提取液在510 nm的吸光度;V為含量測定吸取的提取液體積(mL)

1.2.2單因素實驗天然植物中總黃酮的提取溫度如果較低,總黃酮提取不充分,會導致總黃酮得率較低,隨著提取溫度的升高,總黃酮滲透、擴散和溶解能力增強,從而促進黃酮類化合物的溶出。而如果提取溫度過高,其它非黃酮類化合物也易被提取出來,而且溫度過高,可能會導致部分黃酮類化合物受熱結構被破壞,氧化分解,導致總黃酮得率降低。所以根據(jù)相關文獻[15-16]將文中各組實驗的總黃酮提取溫度設置為50 ℃。

1.2.2.1正丙醇-水比對提取效果的影響稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,料液比為1∶30,硫酸銨質量濃度為0.35 g/mL,正丙醇-水比分別設定為0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1,于微波功率400 W提取5 min,過濾,濾液于分液漏斗中靜置分層,上層醇相以30%乙醇水溶液定容至25 mL,吸取上相溶液適量,按1.2.1節(jié)測定提取液中吸光度值,計算總黃酮得率[17]。計算公式如下:

總黃酮得率(%)=(m1/m2)×100

式中:m1為提取液中總黃酮的質量(g);m2為桔梗莖粉末的質量(g)。

1.2.2.2硫酸銨質量濃度對提取效果的影響稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,料液比為1∶30,正丙醇-水比為0.8∶1,硫酸銨質量濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL,于微波功率400 W提取5 min,然后按1.2.2.1節(jié)實驗,計算總黃酮得率。

1.2.2.3微波時間對提取效果的影響稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,料液比為1∶30,正丙醇-水比為0.8∶1,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,微波功率為400 W，微波提取時間分別為1、5、10、15、20、25 min,然后按1.2.2.1節(jié)實驗,計算總黃酮得率。

1.2.2.4微波功率對提取效果的影響稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,固定正丙醇-水比為0.8∶1,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,料液比為1∶30,設定微波功率分別為300、400、500、600、700、800 W,微波提取5 min,然后按1.2.2.1節(jié)實驗,計算總黃酮得率。

1.2.2.5料液比對提取效果的影響稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,固定正丙醇-水比為0.8∶1,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,料液比分別設定為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45,微波功率為400 W,微波提取5 min,然后按1.2.2.1節(jié)實驗,計算總黃酮得率。

1.2.3正交實驗通過單因素實驗結果可知,正丙醇-水比由0.4∶1提高到0.8∶1時,桔梗莖總黃酮得率由0.265%增加到0.556%,繼續(xù)提高正丙醇-水比,總黃酮得率變化很小,所以在后續(xù)實驗中將正丙醇-水比固定為0.8,在正交實驗中選取硫酸銨質量濃度、提取時間、微波功率、料液比4個因素進行L9(34)正交設計,進一步考察各因素對桔梗莖總黃酮得率的影響,設定正交實驗因素水平,見表1。

表1　正交實驗因素水平表

1.2.4工藝驗證性實驗為了考察上述優(yōu)選的微波協(xié)同雙水相提取桔梗莖總黃酮工藝的穩(wěn)定性,稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,按優(yōu)化的提取工藝條件進行實驗,即正丙醇-水比為0.8∶1、微波提取時間5 min、料液比1∶40,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,微波功率為500 W,重復實驗3次,計算總黃酮得率。同時吸取上層醇溶液45 mL制成干浸膏,測定干浸膏中總黃酮含量。

1.2.5對比實驗稱取脫脂的桔梗莖粉1 g,以正丙醇-水比0.8∶1加入正丙醇水溶液40 mL,設定微波功率為500 W,微波提取5 min,過濾,計算總黃酮得率。同時吸取濾液45 mL制成干浸膏,測定干浸膏中總黃酮的含量。

總黃酮含量(%)=(m1/m2)×100

式中:m1為提取液中總黃酮的質量(mg);m2為桔梗莖提取液干浸膏的質量(mg)。

1.2.6體外抗氧化性實驗

1.2.6.1清除DPPH·實驗DPPH·的乙醇溶液中加入自由基清除劑時,其在517 nm波長處的吸光度變小,該方法可用于評價天然產(chǎn)物對自由基清除能力,用清除率表示,清除率越大,表明該物質清除DPPH·的能力越強。

將桔梗莖總黃酮提取液分別配制成質量濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的供試品溶液。分別吸取不同質量濃度的桔梗莖供試品溶液2.0 mL于10 mL比色管中,加入新鮮配制的0.2 mmoL/L DPPH·溶液2.0 mL,混勻,于室溫暗處避光反應30 min,以50%乙醇溶液作對照,在517 nm處測定吸光度A樣品。其他條件不變,用2.0 mL蒸餾水代替測定A樣品中的桔梗莖供試品溶液,其他操作同上,在517 nm處測定吸光度A空白。分別吸取不同質量濃度的桔梗莖供試品溶液2.0 mL于10 mL比色管中,加入2.0 mL無水乙醇,混勻,其他操作同上,在517 nm處測定吸光度A對照。

將VC配成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的對照溶液,同上操作。按照下式計算桔梗莖總黃酮提取液、VC溶液對DPPH·的清除率[18]。

DPPH·清除率(%)=(A空白-A樣品+A對照)/A空白×100

1.2.6.2清除·OH實驗鄰二氮菲與硫酸亞鐵反應生成紅色配合物,·OH與該配合物反應使鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+,當向其中加入抗氧化劑時,抗氧化劑與·OH作用,從而降低了·OH對Fe2+的氧化,而使吸光度值發(fā)生變化,所以常采用該方法來評價天然產(chǎn)物的抗氧化能力。

將桔梗莖總黃酮提取液分別配制成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的供試品溶液。分別吸取不同質量濃度的桔梗莖供試品溶液1.0 mL于10 mL比色管中,加入濃度為1.5 mmoL/L的鄰二氮菲無水乙醇溶液1.0 mL,依次加入磷酸鹽緩沖液(pH為7.4～7.5)2.0 mL、0.75 mmoL/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL,充分混勻,加入1.0 mL 0.1%的H2O2,37 ℃下恒溫反應60 min,于536 nm處測其吸光度(As)。其他條件不變,用蒸餾水代替測定As中的供試品溶液,于536 nm處測其吸光度(Ap)。其他條件不變,用蒸餾水替代測定AP實驗中的0.1%的H2O2,于536 nm處測其吸光度(Ab)。

將VC配成質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的對照溶液,同上操作。按照下式計算桔梗莖總黃酮提取液、VC溶液對羥基自由基的清除率[19]。

羥基自由基·OH清除率(%)=[(AS-AP)/(Ab-AP)]×100

1.2.7數(shù)據(jù)處理文中每組實驗均重復3次,結果以平均值±標準偏差表示。采用Excel和Origin6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理及統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1總黃酮含量測定

以蘆丁對照品溶液的吸光度為縱坐標,質量濃度(mg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線,回歸方程:A=11.599C+0.0023,r=0.9999。式中:A為所測溶液的吸光度值;C 為溶液中蘆丁的質量濃度(mg/mL)。結果表明蘆丁在0.0072～0.0432 mg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.2單因素實驗

2.2.1正丙醇-醇水比對提取效果的影響由圖1可知,當正丙醇-水比在0.4∶1～0.9∶1范圍內,總黃酮得率先隨著醇水比的增大而逐漸提高,當醇水比為0.8∶1時得率達到較高值,繼續(xù)增加醇水比,得率變化較小。分析其原因可能是因為當醇水比較小時,水用量較多,提取溶劑的極性較高,而桔梗莖總黃酮可能屬于中等級性的成分,隨著醇水比逐漸增加,正丙醇用量逐漸增多,提取溶劑的極性逐漸降低,所以桔梗莖總黃酮的提取得率隨著醇水比的增加而逐漸增加,當醇水比為0.8∶1時得率達到較高值,繼續(xù)增加醇水比,提取溶劑的極性進一步降低,總黃酮得率變化較小。結果見圖1。

圖1　醇水比對提取效果的影響Fig.1　The influence of ratio between ethanol and water on extraction efficiency

2.2.2硫酸銨質量濃度對提取效果的影響由圖2可知,硫酸銨質量濃度由0.20 g/mL增加到0.30 g/mL時,總黃酮得率由0.582%逐漸提高到0.635%,然后開始逐步下降,分析原因可能是因為桔梗莖總黃酮具有一定的醇溶性,隨著硫酸銨質量濃度的增加,上相中正丙醇的相對體積分數(shù)逐漸增加,而下相正丙醇的相對體積分數(shù)則逐漸降低,當硫酸銨質量濃度達到0.30 g/mL時,總黃酮得率達到了最高值,繼續(xù)提高硫酸銨質量濃度,可能是因為在水相中產(chǎn)生了鹽析效應從而使總黃酮得率開始下降。

圖2　硫酸銨質量濃度對提取效果的影響Fig.2　The influence of mass concentration of ammonium sulfate on extraction efficiency

2.2.3微波提取時間對提取效果的影響由圖3可知,隨微波提取時間由1 min延長到5 min時,總黃酮得率就達到了最高值0.613%,繼續(xù)延長提取時間,總黃酮得率由0.613%開始逐漸下降到0.567%。分析原因可能是桔梗莖中黃酮類成分的溶出需要一定時間,時間太短,溶出不完全,從而導致總黃酮得率較低,而如果提取時間過長,桔梗莖中黃酮類成分不再溶出,而且溶劑有一定損失,時間過長會使桔梗莖中的某些黃酮類化合物結構被破壞,所以導致總黃酮得率下降。

圖3　提取時間對提取結果的影響Fig.3　The influence of extraction time on extraction efficiency

2.2.4微波功率對提取效果的影響由圖4可知,當微波功率由300 W提高到400 W時,桔梗莖總黃酮得率就達到了最高值0.635%,當微波功率由400 W繼續(xù)提高到800 W時,總黃酮得率開始隨著微波功率的增加而逐漸下降。分析原因可能是微波功率越大,體系吸收的微波能量就越高,桔梗莖中黃酮類成分的溶出就越多,而當微波功率超過400 W以后,短時間內會使桔梗莖中的部分黃酮類化合物結構被破壞,從而導致總黃酮得率下降。

圖4　微波功率對提取效果的影響Fig.4　The influence of microwave power on extraction efficiency

2.2.5料液比對提取效果的影響由圖5可知,當料液比由1∶25逐漸增加到1∶40時,桔梗莖總黃酮得率由0.542%提高到最高值0.72%,將料液比繼續(xù)增加到1∶45,總黃酮得率略有下降。分析原因可能是料液比太小,提取溶劑滲透并擴散到桔梗莖細胞內的速度以及黃酮類成分向溶劑中擴散的速度較小,桔梗莖中的黃酮類成分提取不充分,從而導致得率低;當料液比增加到一定比例后,總黃酮得率達到了最高值,如果繼續(xù)增加料液比,除黃酮類成分外,其他類物質溶出也較多,可能是溶出的其他類成分干擾了總黃酮的含量測定,從而表現(xiàn)出總黃酮得率略有下降。結果見圖5。

圖5　料液比對提取效果的影響Fig.5　The influence of ratio between material and solvent on extraction efficiency

2.3正交實驗

正交實驗結果見表2。通過正交實驗結果可知4種因素對桔梗莖總黃酮得率的影響大小依次為:B>C>A>D,即微波提取時間>微波功率>硫酸銨質量濃度>料液比。桔梗莖總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B2C3D2,即正丙醇-水比固定為0.8∶1、微波提取時間5 min、料液比1∶40,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,微波功率為500 W。

表2　正交實驗結果

2.4工藝驗證性實驗

3次工藝驗證實驗桔梗莖總黃酮的得率分別為0.798%、0.793%、0.789%,平均為0.793%,RSD為0.57%。干浸膏中的總黃酮的含量分別為13.54%、13.47%、13.44%,平均為13.48%,實驗結果表明,經(jīng)過單因素及正交實驗優(yōu)選的桔梗莖總黃酮提取工藝條件穩(wěn)定,適合規(guī)?；a(chǎn)。

2.5對比實驗

在不加入分相鹽硫酸銨的條件下,按照上述提取工藝進行微波提取3次,同法制成干浸膏。總黃酮的得率分別為0.818%、0.809%、0.813%,平均為0.813%。經(jīng)含量測定可知干浸膏中的總黃酮的含量分別為10.43%、10.41%、10.47%,平均為10.44%。由實驗結果可知,微波協(xié)同雙水相提取法的總黃酮得率略低于微波提取法,但由于分相鹽硫酸銨的加入,使微波協(xié)同雙水相提取法制備的干浸膏中總黃酮含量明顯高于微波提取法,結果表明雙水相對桔梗莖中的黃酮類成分起到了一定的富集作用。

2.6體外抗氧化性實驗

2.6.1清除DPPH·實驗由圖6可知,黃酮提取液和VC溶液對DPPH·的清除率均隨著其質量濃度的增加而逐漸增大,當桔梗莖總黃酮提取液和VC溶液質量濃度為0.6 mg/mL時,其對DPPH·的清除率分別為88.69%、90.82%。實驗結果表明,桔梗莖總黃酮提取液對DPPH·具有明顯的清除能力,其清除能力與VC溶液相差無幾,結果見圖6。

圖6　VC對照液、桔梗液對DPPH·的清除率Fig.6　The scavenging ratio of VC control solution and Platycodon grandiflorum solution to DPPH·

2.6.2清除·OH實驗由圖7可知,桔梗莖總黃酮提取液和VC溶液對·OH的清除率均隨著其質量濃度的增加而逐漸增大,當桔梗莖總黃酮提取液和VC溶液質量濃度為0.6 mg/mL時,其對·OH的清除率分別為69.72%、85.28%。實驗結果表明,桔梗莖總黃酮提取液對·OH具有一定的清除能力,其清除能力低于VC溶液。

圖7　VC對照液、桔梗莖提取液對·OH的清除率Fig.7　The scavenging ratio of VC control solution and Platycodon grandiflorum solution to ·OH

3　結論

本實驗采用單因素和正交實驗法對微波協(xié)同雙水相提取桔梗莖總黃酮的工藝進行了優(yōu)化。其最佳工藝條件為:取脫脂后的桔梗莖粉末適量,以正丙醇水溶液為提取溶劑,正丙醇-水比固定為0.8∶1,料液比1∶40,硫酸銨質量濃度為0.30 g/mL,在50 ℃于微波功率500 W下提取5 min,過濾,濾液于分液漏斗中靜置分層,上層醇相以30%乙醇水溶液定容至25 mL,吸取上相溶液適量,按1.2.1節(jié)測定提取液中吸光度值,計算總黃酮得率。在此工藝條件下,桔梗莖總黃酮得率為0.793%,提取干浸膏中的總黃酮的含量為13.48%,結果表明微波協(xié)同雙水相提取法制備的干浸膏中總黃酮含量明顯高于微波提取法。本實驗同時采用分光光度法研究了桔梗莖總黃酮提取液的抗氧化活性,結果表明:桔梗莖總黃酮提取液對DPPH·具有明顯的清除能力,其清除能力與VC溶液相當;桔梗莖總黃酮提取液對·OH具有一定的清除能力,但其清除能力略低于VC溶液。

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Study on extraction technology of total flavonoids inPlatycodongrandiflorumstems with aqueous two-phase cooperated with microwave methods and its antioxidant ability

ZHONG Fang-li1,WANG Wen-jiao1,2,WANG Xiao-lin1,*,XIU Yang-yang1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China;2.School of Chemistry,Jilin University,Changchun 130012,China)

Aqueous two-phase cooperated with microwave methods were applied to explore the extraction technology of total flavonoids inPlatycodongrandiflorumstems and its antioxidant abilityinvitrowas studied. First,the extraction technology was optimized by single factor and orthogonal test,while the scavenging activity of total flavonoids extraction solution to DPPH· and ·OH were measured by spectrophotometric method. When the ratio between material and solvent,the microwave power,the ratio between ethanol and water,the extraction time and the mass concentration of ammonium sulfate were 1∶40(m/v),500 W,0.8∶1,5 min and 0.30 g/mL respectively,the much higher average extraction yield of total flavonoids could reach about 0.793%. The activity test had shown that total flavonoids solution extracted fromPlatycodongrandiflorumstems had strong scavenging activity to DPPH· and ·OH,and the scavenging activity might gradually be enhanced with the increase of mass concentration of total flavonoids in extraction solution.

Platycodongrandiflorumstems;aqueous two-phase;total flavonoids;antioxidant

2015-11-11

鐘方麗(1970-)，女，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物化學成分的分離與生物活性等方面的工作，E-mail：fanglizhong@sina.com。

王曉林(1969-)，男，碩士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物有效成分的提取及純化工藝等方面的工作，E-mail：wangxiaolin69@eyou.com。

TS255.1

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1002-0306(2016)12-0267-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.042