王　帥,尹　花,任紅霞,侯旭光,繆錦來,鄭　洲,*

(1.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室,山東青島 266061;2.山東大學(xué)威海分校,山東威海 264209;3.國家海洋局生物活性物質(zhì)重點實驗室,山東青島 266061;4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東青島 266109)

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南極假絲酵母Pseudozymasp. JCC207的培養(yǎng)及其海藻糖提取工藝優(yōu)化

王帥1,2,3,尹花1,+,任紅霞4,侯旭光2,繆錦來3,鄭洲3,*

(1.啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室,山東青島 266061;2.山東大學(xué)威海分校,山東威海 264209;3.國家海洋局生物活性物質(zhì)重點實驗室,山東青島 266061;4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東青島 266109)

本文研究了南極假絲酵母Pseudozymasp. JCC207的培養(yǎng)條件,對其海藻糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用單因素實驗研究了培養(yǎng)溫度和初始pH對南極假絲酵母生長的影響,采用RSM分析法確定了三氯乙酸(TCA)法提取南極假絲酵母海藻糖的最優(yōu)工藝。結(jié)果表明其最適培養(yǎng)溫度為25 ℃,起始pH為5～9范圍內(nèi)酵母生長情況差別不大;最優(yōu)提取條件為:三氯乙酸濃度0.6 mol/L、體積15.20 mL、提取時間29 min;每克南極假絲酵母濕菌體中海藻糖的提取量為17.72 mg;功能實驗表明,與甘油(20%)和二甲基亞砜(10%)等傳統(tǒng)保種試劑相比,0.5%海藻糖溶液在短期內(nèi)(5 d)對酵母具有更好的保種能力。

南極假絲酵母,培養(yǎng)條件,海藻糖,提取工藝,優(yōu)化

極地微生物是極地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。由于極地獨(dú)特的地理、氣候及環(huán)境特點,極地微生物所具有的新穎性與多樣性,在科學(xué)研究、應(yīng)用開發(fā)等方面都具有重要價值,并逐漸受到人們的廣泛關(guān)注。有關(guān)極地微生物的資源勘探與代謝活性產(chǎn)物研究,已成為國際微生物學(xué)研究的熱點之一,但關(guān)于極地酵母海藻糖的研究還鮮有報道。

海藻糖是由兩個葡萄糖分子組成的一個非還原性雙糖[1],廣泛存在于細(xì)菌[2]、真菌[3]、酵母、藻類、低等植物、昆蟲及無脊椎動物中[4-5],尤其是在酵母細(xì)胞中含量高達(dá)15%。海藻糖在水中溶解性好且很穩(wěn)定,對環(huán)境變化形成的應(yīng)激狀態(tài)具有高抗性,可防御如高溫、冷凍、脫水和高滲透壓等不利環(huán)境因素,外源性的海藻糖同樣對生物體和生物大分子有良好的非特異性保護(hù)作用[6-8]。添加海藻糖被認(rèn)為是保護(hù)細(xì)胞抵抗冷凍的一種有前途的方法,研究發(fā)現(xiàn)添加外源海藻糖明顯地提高了極端環(huán)境酵母細(xì)胞的存活率[6]。目前,海藻糖已被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品等行業(yè)[9-12]。

目前生產(chǎn)海藻糖的方法主要有酶轉(zhuǎn)化法和酵母提取法,因酵母極易富集和培養(yǎng),使得酵母提取法成為國內(nèi)外生產(chǎn)海藻糖的首選方法[13-14]。用酵母生產(chǎn)海藻糖是利用優(yōu)化過的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件來達(dá)到海藻糖在菌體內(nèi)大量積累,然后再進(jìn)行提取的過程。海藻糖提取用到的方法主要有水提取法、乙醇提取法、三氯乙酸(TCA)提取法及微波預(yù)處理提取法。劉洋等[15]分別用三氯乙酸、冷乙醇、熱乙醇和熱蒸餾水浸提海藻糖,結(jié)果顯示三氯乙酸溶液浸提產(chǎn)率最高,且酵母菌用三氯乙酸提取,所得溶液僅有海藻糖存在。因此,本實驗研究了南極假絲酵母Pseudozymasp. JCC207的培養(yǎng)條件,并對其海藻糖的三氯乙酸法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,初步探索了海藻糖在酵母保種過程中的作用,以期為極地酵母海藻糖資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南極假絲酵母Pseudozymasp. JCC207國家海洋局海洋活性物質(zhì)重點實驗室保存;種子培養(yǎng)基1000 mL蒸餾水中加入葡萄糖8 g,酵母膏2 g,MgSO41 g,K2HPO41 g,溶解調(diào)pH7,115 ℃蒸汽滅菌30 min,該培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基和實驗優(yōu)化設(shè)計的初始培養(yǎng)基;固體培養(yǎng)基1000 mL蒸餾水中加入胰蛋白胨4 g,酪蛋白胨2 g,酵母膏2 g,牛肉膏1.5 g,葡萄糖1 g,溶解調(diào)pH7,加入瓊脂20 g,115 ℃蒸汽滅菌30 min;海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司;二甲基亞砜(DMSO)天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酯(TCA)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酵母浸膏國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蒽酮上海科豐實業(yè)有限公司;硫酸鎂天津市博迪化工有限公司。

Eppendorf 5804離心機(jī)Eppendorf中國有限公司;FD50A高壓滅菌器致微儀器有限公司;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公公司;SW-CJ-2D凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司;UV-2550紫外分光光度計島津有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1南極酵母培養(yǎng)及菌體制備將活化的南極酵母種子液接入250 mL種子培養(yǎng)基中,接種量為2%放入振蕩培養(yǎng)箱中,在20 ℃、160 r/min條件下,振蕩培養(yǎng)48 h,得到所需酵母菌液。將發(fā)酵液在8000 r/min離心10 min除去上清液,加蒸餾水洗滌2次,濕酵母放冰箱-20 ℃。貯存待用。

1.2.2培養(yǎng)溫度對南極假絲酵母生長的影響將活化的實驗菌種按照2%的接種量加入到100 mL種子培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),初始培養(yǎng)條件為160 r/min,pH7,設(shè)置15、20、25和30 ℃四個溫度進(jìn)行培養(yǎng),每隔12 h取樣測定OD600,繪制不同培養(yǎng)溫度下酵母菌的生長曲線。

1.2.3培養(yǎng)基初始pH對南極假絲酵母生長的影響用6 mol/L的鹽酸、氫氧化鈉溶液將培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)整為5、6、7、8和9,南極酵母接種量為2%,然后在20 ℃、160 r/min進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),每隔12 h取樣測定OD600,繪制不同初始pH下酵母菌的生長曲線。

1.2.4海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別量取1 mg/1000 μL海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、25、50、100、150、200 μL,然后各自加蒸餾水至2 mL,再向各管中加入0.2%的蒽酮-硫酸試劑8 mL,立即搖勻,并置于沸水浴中加熱2 min后取出,并用自來水沖洗快速冷卻。以未加海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品的樣液作為空白對照,在590 nm下測定溶液的吸光度值[16]。以制得的海藻糖質(zhì)量為橫坐標(biāo),測出的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5TCA法提取海藻糖在1 g濕酵母中加15 mL TCA溶液(0.5 mol/L)于冰水浴中提取30 min,將提取液以8000 r/min的速度離心5 min,取上清液待測。重復(fù)上述步驟,共提取6次。

1.2.6提取時間、TCA濃度和體積對海藻糖提取量的影響按照1.2.5中的方法,加入15 mL 0.5 mol/L TCA溶液,分別提取10、20、30、40、60 min后,依次測定各上清液中海藻糖含量;加入15 mL濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的TCA溶液,提取30 min后,依次測定各上清液中海藻糖含量;分別加入10、15、20、25 mL濃度為0.6 mol/L的TCA溶液,提取30 min后,依次測定各上清液中海藻糖含量。

1.2.7Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化海藻糖提取的最佳工藝條件設(shè)計在1.2.6單因素實驗的基礎(chǔ)上,依據(jù)中心組合(Box-Behnken)設(shè)計原理[17-19],選取TCA溶液的濃度、體積和提取時間三個因素為自變量因子,依次記作A、B、C,海藻糖提取量為響應(yīng)值,記作Y,設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)曲面實驗(RSM),根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計因素水平編碼表,見表1。

表1　RSM因素水平編碼表

利用Minitab15分析軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計,分析實驗結(jié)果,再通過Design-Expert 8.0.6對該結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,找出海藻糖提取時的最優(yōu)條件。

1.2.8海藻糖對于酵母保種的功能驗證將菌液按2%接種量接種到100 mL、pH7種子培養(yǎng)基中,放入振蕩培養(yǎng)箱中,在20 ℃、160 r/min條件下,振蕩培養(yǎng)12 h,得到所需保種酵母菌液。保種試劑選用20%甘油、10% DMSO、0.5%、1%、2%海藻糖溶液以及空白作為對照,-80 ℃分別保種5、10、20和40 d。取保種樣品,每個樣品取樣1 μL用種子培養(yǎng)基稀釋至10倍,涂布于固體培養(yǎng)基平板中,室溫培養(yǎng)48 h,計數(shù)。

1.2.9數(shù)據(jù)分析每組實驗重復(fù)三次,實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)溫度對南極假絲酵母生長的影響

南極酵母在不同溫度下的生長曲線見圖1?？梢钥闯?溫度對南極假絲酵母的生長存在一定影響,對數(shù)生長期,培養(yǎng)溫度越高,酵母生長的越快;穩(wěn)定期,酵母在25 ℃測得的生長曲線最高,20 ℃測得生長曲線與25 ℃非常接近,其次是30 ℃時生長曲線,15 ℃酵母的生長曲線最低。

圖1　南極假絲酵母在不同培養(yǎng)溫度下的生長曲線Fig.1　The growth curve of Candida antarctica with different culture temperatures

2.2培養(yǎng)基初始pH對南極假絲酵母生長的影響

不同pH下酵母生長曲線見圖2。可以看出,實驗培養(yǎng)的南極假絲酵母在不同初始pH下的生長情況變化不大,從酸性pH5到堿性pH9,該酵母生長呈現(xiàn)較好的一致性,說明該菌種可適應(yīng)的pH范圍較大,為廣譜性,也得知pH對該酵母生長影響較小。

圖2　南極假絲酵母在不同初始pH下的生長曲線Fig.2　The growth curve of Candida antarctica under different initial pH value

2.3海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

實驗中分別測定了5個不同濃度下海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在590 nm下的吸光度值,以海藻糖的質(zhì)量為橫坐標(biāo),測得的吸光度值為縱坐標(biāo),繪制出海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,其回歸方程為Y=3.90189X+0.00308,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,線性關(guān)系良好。

圖3　海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　The standard curve of trehalose

2.4海藻糖提取的單因素實驗

2.4.1不同提取時間對海藻糖提取量的影響提取時間對海藻糖提取量的影響見圖4,隨著TCA提取時間的增加,酵母提取液中海藻糖的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,提取30 min時達(dá)到最大。原因可能是在一定的TCA提取時間內(nèi),海藻糖由胞內(nèi)滲出基本達(dá)到平衡,過度延長TCA提取時間后,由于時間過長,導(dǎo)致酵母細(xì)胞中其它非目標(biāo)物質(zhì)的分解和溶出,從而阻礙海藻糖的繼續(xù)提取,影響了提取海藻糖量。因而選取TCA提取時間為30 min。

圖4　不同提取時間下海藻糖含量Fig.4　Trehalose content under different extraction time

2.4.2不同TCA濃度對海藻糖提取量的影響在提取過程中,TCA作為一種強(qiáng)變形劑,能將多種蛋白質(zhì)、海藻糖酶和多糖等變性沉淀,海藻糖便從胞內(nèi)浸提出來。TCA濃度對海藻糖提取量的影響見圖5,用濃度為0.6 mol/L的TCA溶液提取得到的海藻糖量最多,其他3個濃度提取的海藻糖較少。濃度為0.5 mol/L和0.7 mol/L的海藻糖含量與0.6 mol/L的相差較大,說明在提取過程中TCA溶液的濃度對提取量的影響很大。在一定濃度范圍內(nèi),TCA濃度越大,變性作用越強(qiáng),使海藻糖酶失活率越高,海藻糖提取量便越多;但當(dāng)TCA濃度過高時,形成的較高滲透壓環(huán)境會使菌體細(xì)胞壁皺縮,進(jìn)而海藻糖不易溶出,使提取量降低[20]。

圖5　不同TCA濃度下得到的海藻糖含量Fig.5　Trehalose content under different concentration of chloroacetic acid

2.4.3不同TCA體積對海藻糖提取量的影響三氯乙酸體積對海藻糖提取量的影響見圖6,TCA體積對酵母海藻糖得量的影響呈先升而后降的趨勢,在TCA體積為15 mL時海藻糖量達(dá)到最大。當(dāng)TCA溶液的體積較少時,對酵母中海藻糖的浸提作用不充分,不能達(dá)到充分提取;隨著TCA溶液體積的增加,提取過程越來越充分,得到的海藻糖量也越來越多;但是當(dāng)其體積過高時,提取溶液極性變小,反而抑制水溶性海藻糖的提取[20]。

表3　回歸方程的方差分析

圖6　不同提取體積下海藻糖含量Fig.6　Trehalose content under differentextraction volume of chloroacetic acid

注:當(dāng)p<10-6時,p值顯示為0.0000。

2.5RSM優(yōu)化海藻糖提取工藝

2.5.1回歸方程的建立和方差分析利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化海藻糖提取的實驗設(shè)計和結(jié)果如表2所示,借助Design-Expert統(tǒng)計分析軟件對表2中的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合,得到海藻糖提取量(Y)對TCA濃度A、TCA體積B和提取時間C的回歸方程為:

Y=17.8343+0.4123A+0.2733B-0.2692C+0.0190AB+0.1955AC+0.1395BC-5.8369A2-4.2789B2-5.3744C2

表2　響應(yīng)曲面分析法實驗設(shè)計和結(jié)果

對該回歸方程進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性分析,結(jié)果分別見表3和表4。從表3回歸方程的方差分析可知失擬項F=1.57,p=0.413>0.05,不顯著,說明模型不存在失擬因素。表4回歸系數(shù)的顯著性分析顯示擬合回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9987,和軟件預(yù)測值R2=0.9843相差較小,表明該模型與實驗擬合性良好。綜上可知,該模型的擬合程度較高,具有較好的預(yù)測作用。

由表4中各項系數(shù)的p值可知,在所選因素水平范圍內(nèi),對海藻糖提取量影響作用由大到小的順序為TCA溶液濃度>TCA法體積>提取時間。其中,一次項A和平方項A2、B2、C2是模型的極顯著因素(p<0.01),一次項B和C為顯著因素(p<0.05),交互項AB、AC、BC影響不顯著(p>0.05)。

表4　回歸系數(shù)的顯著性分析

2.5.2響應(yīng)曲面分析借助Design-Expert 8.0.6對2.5.1中的設(shè)計結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)曲面分析,TCA濃度、體積和提取時間三種因素對海藻糖提取量的響應(yīng)面影響分別見圖7、圖8和圖9。由圖7可知,在一定的TCA濃度條件下,提取過程中當(dāng)TCA溶液的體積在10～15 mL范圍內(nèi)和提取時間在20～30 min范圍內(nèi)時,這兩種變化因素分別表現(xiàn)出顯著的增效作用,即隨著TCA體積的增加和提取時間的延長海藻糖的提取量也隨之增加;但是當(dāng)超過15 mL和30 min后,海藻糖的提取量反而隨著TCA體積和提取時間的增加出現(xiàn)降低的趨勢。

圖7　TCA體積和提取時間對海藻糖提取量的響應(yīng)曲面圖Fig.7　Response surface of TCA volume and extraction time vs trehaloseextraction content with constant value of TCA concentration

在TCA溶液體積為一定值的條件下,考察TCA濃度和提取時間兩因素對海藻糖提取量的影響。如圖8所示,在TCA溶液的濃度由0.5 mol/L增加到0.6 mol/L的范圍內(nèi)和提取時間由20 min變化到30 min的范圍內(nèi),海藻糖的提取量也隨之增加;當(dāng)超過0.6 mol/L和30 min后,海藻糖的提取量隨TCA濃度和提取時間的增加呈現(xiàn)出減小的現(xiàn)象。

圖8　TCA濃度和提取時間對海藻糖提取量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.8　Response surface of TCA concentration and extraction time vs trehalose extraction content with constant value of TCA volume

圖9　提取時間一定時TCA濃度和體積對海藻糖提取量的響應(yīng)曲面圖Fig.9　Response surface of TCA concentration and its volume vs trehalose extraction content with constant value of extraction time

在提取時間為一定值的條件下,研究TCA濃度和體積時間2個變量對海藻糖提取量的影響。如圖9所示,當(dāng)TCA溶液濃度由0.5 mol/L變化到0.6 mol/L和體積由10 mL變化到15 mL時,得到的海藻糖提取量也呈現(xiàn)出相應(yīng)的增加;TCA溶液超過0.6 mol/L和15 mL后,所得海藻糖提取量隨兩因素的增加而減小。

2.5.3驗證實驗利用響應(yīng)面分析法得到提取最優(yōu)條件為:TCA濃度0.60 mol/L、體積15.16 mL、提取時間29.76 min,在此條件下,海藻糖的理論提取量為17.90 mg/g。為驗證由響應(yīng)曲面法得到的最優(yōu)條件是否可靠、準(zhǔn)確,本實驗實際選取TCA濃度0.6 mol/L、體積15.20 mL和提取時間29 min的提取條進(jìn)行驗證,得到的海藻糖提取量為17.72 mg,接近海藻糖的理論提取量;這說明利用響應(yīng)曲面法得到的優(yōu)化提取條件可靠,具有較好的實際應(yīng)用價值。

2.6海藻糖對酵母保種作用結(jié)果

通過平板計數(shù)得出結(jié)果見表5,0.5%海藻糖在-80 ℃處理5 d的保種效果最好,20%甘油在-80 ℃處理10、20和40 d的保種功能最好。不同海藻糖濃度取得的保種效果不同,其中0.5%的效果最為顯著;-80 ℃保種5 d,0.5%的海藻糖溶液對酵母的保種作用最好,隨著保種時間延長,保種功能迅速下降。該結(jié)果表明外源海藻糖可在短期內(nèi)明顯地提高冷凍條件下酵母細(xì)胞的存活率,證實了海藻糖對于酵母保種中的作用,表明海藻糖有助于酵母應(yīng)對極端低溫環(huán)境。

表5　各保種試劑中菌落數(shù)

注:與空白組比較**表示差異極顯著(p<0.01),*表示差異顯著(0.01

3　結(jié)論

研究表明南極假絲酵母最適溫度為25 ℃,培養(yǎng)基初始pH在5～9范圍內(nèi)對酵母生長影響不大。利用響應(yīng)面法優(yōu)化了南極假絲酵母海藻糖的提取條件,確定海藻糖提取的最佳工藝參數(shù)為:TCA濃度0.6 mol/L、體積15.20 mL、提取時間為29 min,在此最優(yōu)工藝下每克南極假絲酵母濕菌體中海藻糖的提取量為17.72 mg。與甘油(20%)和二甲基亞砜(10%)等傳統(tǒng)保種試劑相比,0.5%海藻糖溶液在短期內(nèi)(5 d)對酵母具有更好的保種能力。

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Optimization of culture conditions and trehalose extractive technology ofPseudozymasp. JCC207

WANG Shuai1,2,3,YIN Hua1,+,REN Hong-xia4,HOU Xu-guang2,MIAO Jin-lai3,ZHENG Zhou3,*

(1.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer,Qingdao 266061,China;2.Shandong University,Weihai,Weihai 264209,China;3.Key Laboratory of Marine Bioactive Substance,State Oceanic Administration,Qingdao 266061,China;4.Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The culture conditions ofPseudozymasp.JCC207 from Antarctic and the optimization of the extractive technology for its trehalose were studied in this paper. Effects of culture temperature and initial pH of culture medium onPseudozymasp.JCC207 growth were explored by single factor tests,and the optimization of extraction condition of yeast trehalose by rchloroacetic acid(TCA)was determined using response surface method(RSM).The results showed that the optimum culture temperature was 25 ℃,and initial pH value of 5 to 9 impacted little on yeast growth,and the optimal extraction conditions were obtained as follows:TCA concentration 0.6 mol/L,TCA volume 15.20 mL,and extraction time 29 min. The extraction amount was 17.72 mg from one gram wet cells ofPseudozymasp. JCC207. Function test indicated that 0.5% trehalose solution had a better conservation capacity for yeast in 5 days compared with 20% glycerol and 10% dimethyl sulphoxide(DMSO).

Pseudozymasp.JCC207;culture conditions;trehalose;extraction;optimization

2015-12-18+并列第一作者。

王帥(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物，E-mail：524207035@qq.com。

尹花(1972-)，女，碩士，應(yīng)用研究員，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：yinhua@tsingtao.com.cn。

鄭洲(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：應(yīng)用微生物，E-mail：zhengzhou@fio.org.cn。

啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室開放基金(K2014003)；全球變化與海氣相互作用專項(GASI-03-02-02-05)；國家自然科學(xué)基金(31200272)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)12-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.031