陶涌 李鴻程 毛誼平 沈銀梅 任榮軍 歐陽毅

氨基甲酸酯農(nóng)藥自上世紀(jì)五十年代商品化后，因其對多種害蟲有良好的殺蟲效果而被廣泛用于糧食、蔬菜和水果等的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，是目前使用量較大的殺蟲劑之一。此外，氨基甲酸酯類化合物也作為殺蟲劑用于工業(yè)，其它行業(yè)及家用產(chǎn)品。大多數(shù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥在水中有較高溶解度，所以廣泛分布于水環(huán)境中。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明此類化合物可以通過土壤淋溶和地表徑流進(jìn)入地下水和地表水，從而蔓延至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。美國國家環(huán)保局（EPA）已將氨甲酸酯類農(nóng)藥列入優(yōu)先控制污染名單。相關(guān)研究結(jié)果顯示氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物是潛在的環(huán)境和食品污染物。隨之，許多國家和地區(qū)對這類農(nóng)藥在食品中的殘留制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，使得氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析檢測技術(shù)備受關(guān)注。因此，建立一種簡單，高效，靈敏的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法具有重要意義。

目前，用于極性農(nóng)藥殘留的主要檢測手段是色譜技術(shù)，包括氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）。然而，由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥自身的熱不穩(wěn)定性，GC直接檢測此類化合物時(shí)將不可避免的損失部分目標(biāo)物，從而降低方法的靈敏度。因此，通常氨基甲酸酯必須先通過衍生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定性衍生物，再進(jìn)行分析測定。對于高沸點(diǎn)或穩(wěn)定性差的化合物，高效液相色譜法則可以進(jìn)行有效的分離檢測，特別適合氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析。

在食品分析檢測中，由于樣品基體的復(fù)雜性和極低的污染物含量，樣品前處理是最復(fù)雜和耗時(shí)的步驟，通常占了整個(gè)分析過程的70%以上。一個(gè)有效的樣品前處理技術(shù)是將痕量農(nóng)藥殘留從復(fù)雜基質(zhì)中提取的過程，同時(shí)也是一個(gè)富集，濃縮和凈化的過程。不同種類的農(nóng)藥殘留及其代謝產(chǎn)物主要根據(jù)其自身特性如極性，離子特性以及穩(wěn)定性等選擇相應(yīng)的提取方式。迄今為止，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的樣品前處理技術(shù)有固相萃?。⊿PE），液液萃?。↙LE），超臨界萃?。⊿FE），加速溶劑萃?。ˋSE）以及固相微萃取（SPME）等。而SPE，LLE，SFE等萃取過程耗時(shí)耗力，萃取效率低；并且需要消耗大量有機(jī)溶劑，引起環(huán)境的二次污染。SPME是一種較新發(fā)展的樣品前處理技術(shù)，全程不使用有機(jī)溶劑，在各領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。但它仍需解決與HPLC聯(lián)用的接口技術(shù)問題。HF-SLME是1999年發(fā)展起來的一種新型樣品前處理技術(shù)。它通過微量有機(jī)溶劑對目標(biāo)分析物進(jìn)行萃取同時(shí)，實(shí)現(xiàn)采樣、分離、富集。該技術(shù)不僅操作簡單，成本低廉，且具有較好的選擇性和較高的富集倍數(shù)，能有效地解決溶劑殘留問題，是一種環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)。

本文將中空纖維支載液膜微萃取與HPLC/DAD聯(lián)用技術(shù)成功應(yīng)用于蔬菜樣品中多種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的分析測定，通過對影響萃取效率的相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化，獲得了較高的富集倍數(shù)，以及低于國家標(biāo)準(zhǔn)中的方法檢出限。

實(shí)驗(yàn)部分

試劑與儀器。速滅威（metolcarb）、克百威（carbofuran）、甲萘威（carbaryl）和異丙威（isoprocarb）4種殺蟲劑標(biāo)準(zhǔn)品（甲醇為溶劑，標(biāo)準(zhǔn)值100 μg/mL）購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。實(shí)驗(yàn)中所用有機(jī)試劑均為分析純。甲醇為色譜純購于Baker公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。聚丙烯中空纖維 Accurel Q3/2（孔徑0.2 μm，內(nèi)徑600 μm，壁厚200 μm，孔率75%）和50/280聚丙烯中空纖維（內(nèi)徑280 μm，壁厚50 μm，孔徑0.1 μm， 孔率60%）（德國Membrana GmbH公司）。1mL一次性無菌注射器為德國B.Braun公司制品，針頭外徑0.3 mm，長8 mm。

氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將1 mL 4種標(biāo)準(zhǔn)品全部轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶，用甲醇分別定容，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液待用。使用時(shí)用甲醇進(jìn)一步稀釋。

色譜條件。安捷倫1260 Infinity HPLC系統(tǒng)包括G1315D DAD檢測器和G1311B四元泵。色譜柱為Zorbax XDB-C18（250 mm × 4.6 mm × 5 μm）；流動相：甲醇-水，體積比60：40，流速1 mL/min下等度洗脫。檢測波長：甲萘威220 nm，其余3種物質(zhì)為200 nm。

HF-SLME萃取過程。HF-SLME萃取裝置與作者之前發(fā)表的工作類似?，F(xiàn)簡述如下：將長約12 cm中空纖維用丙酮超聲清洗，晾干備用；用水注滿纖維內(nèi)腔，將其浸入提前配制好的有機(jī)膜液5 min，使小孔內(nèi)充滿有機(jī)液體。取出中空纖維，用水將其內(nèi)、外表面沖洗5次，以洗去殘留在表面上的多余的有機(jī)液體。通過一次性注射器將接受相注入內(nèi)腔直至充滿，然后彎曲纖維成環(huán)狀，將纖維兩端用鋁箔封裹后，直接浸沒于樣品溶液中進(jìn)行振蕩萃取。萃取結(jié)束后，取出纖維，去除封口鋁箔，用注射器將約20 μL接受相吹出，取10 μL進(jìn)HPLC/DAD分析測定。

樣品制備。所有蔬菜樣品均購于本地農(nóng)貿(mào)市場。將新鮮蔬菜切成小塊后放入食品攪拌機(jī)內(nèi)進(jìn)行充分勻漿。取20.0g勻漿放入50 mL離心管，5000 rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液。用1 mL甲醇溶解沉淀物，渦旋震蕩1min后離心，取出上清液。重復(fù)此過程兩次。收集所有上清液，用超純水定容至20 mL待用。

結(jié)果與討論

中空纖維的選擇。實(shí)驗(yàn)中選擇Q3/2和PP50/280兩種聚丙烯中空纖維作為液膜載體，考查其對萃取效率隨時(shí)間變化的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)初始條件供體相為20 mL，0.01M HCl溶液，加標(biāo)50 μg/L；二己基醚（DHE）為有機(jī)液膜相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)Q3/2纖維作為液膜載體時(shí)4種化合物的富集倍數(shù)相對于PP50/280纖維來說要低2～3倍，其可能原因在于PP50/280中空纖維的比表面積比Q3/2要大，致使它對分析物的吸附量要高。因此，實(shí)驗(yàn)中選用PP50/280中空纖維作為液膜載體。

有機(jī)液膜的選擇。在液相微萃取過程中，選擇合適的有機(jī)溶液作為液膜相是影響萃取效率的一個(gè)至關(guān)重要的因素。預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了兩種經(jīng)典膜試劑：極性試劑二己基醚（DHE）和非極性試劑正十一烷（UND）對目標(biāo)化合物的萃取效率。初步結(jié)果顯示：DHE的萃取效率比UND至少高1/3，結(jié)果符合“相似相溶”原理，因此極性DHE更適合極性氨基甲酸酯類農(nóng)藥的萃取，但獲得的富集倍數(shù)都較低。為了進(jìn)一步提高富集倍數(shù)，分別在有機(jī)液膜中加入三辛基氧化膦（TOPO） 作為輔助萃取劑，進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Fig.1）表明：加入一定比例的TOPO后，萃取效率得到明顯改善。其原因在于TOPO分子中的氧原子可與氨基甲酸酯化合物結(jié)構(gòu)上的氨基氫形成氫鍵，從而增加了液膜的吸附能力。因此，實(shí)驗(yàn)選擇DHE/TOPO混合溶劑作為萃取溶劑。

攪拌和振蕩方式對萃取效率的影響。為了加速萃取中的傳質(zhì)過程，通常采用磁力攪拌和振蕩兩種不同運(yùn)動方式來增加溶質(zhì)分子的擴(kuò)散速率。在實(shí)驗(yàn)中，分別對50，150，300 rpm三種不同速率的攪拌和振蕩進(jìn)行了比較。結(jié)果如Fig.2所示，在同等的實(shí)驗(yàn)條件下，4種分析物的萃取效率在兩種加速方式下都隨著速度的增加而增加。相比較而言，振蕩萃取獲得的富集倍數(shù)（EFs： 35-52）和萃取穩(wěn)定性（RSD%： 0.2-5.1%）比攪拌萃取要好（EFs：22-35； RSD%： 0.3-11.5%）。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)300 rpm攪拌萃取時(shí)，樣品溶液容易產(chǎn)生氣泡，黏附在纖維壁上，阻礙分析物進(jìn)入纖維孔中的液膜相，影響萃取的重現(xiàn)性。因此，實(shí)驗(yàn)選擇300 rpm振蕩方式加速萃取。

供體相和接受相pH值的選擇。通過調(diào)節(jié)樣品溶液pH值，可以使被萃取化合物在整個(gè)萃取過程中實(shí)現(xiàn)由樣品溶液到接受相的單向流動，從而達(dá)到最大程度分離和富集目的。根據(jù)以上萃取原理，實(shí)驗(yàn)考查了供體相溶液在pH 2～9范圍內(nèi)萃取效率的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在低于pH 7條件下，萃取效率幾乎不隨pH變化而變化；大于pH 8時(shí)，萃取效率降低。這可能是由于氨基甲酸酯類農(nóng)藥在酸性條件下穩(wěn)定存在，而在堿性條件下發(fā)生分解這一特性引起。同時(shí)由于常見果蔬的pH值在5.5-7.0之間，勻漿后的汁液呈弱酸性，所以在實(shí)際樣品萃取過程無需調(diào)節(jié)pH值。

供體相離子強(qiáng)度的選擇。對大多數(shù)萃取過程而言，通過鹽析作用可以增加分析物在有機(jī)相中的分配系數(shù)，從而提高萃取效率。此外，有研究證明，適當(dāng)增加樣品溶液離子強(qiáng)度，可以抑制乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，增強(qiáng)液膜的穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)中加入不同量的Na2SO4到樣品溶液中，以考查鹽濃度對此次萃取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在Na2SO4濃度達(dá)到1 M之前，萃取效率隨著Na2SO4濃度增加而提高，進(jìn)一步增加鹽濃度，萃取效率反而下降。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是萃取過程中，有兩種效應(yīng)的共同作用，即“鹽析效應(yīng)”和“靜電效應(yīng)”。在萃取初期，鹽析作用占主導(dǎo)地位，樣品中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥盡可能多地從樣品溶液中釋放出來，進(jìn)入到有機(jī)液膜相中。而隨著鹽濃度的增加，Na+和SO42-靜電作用力加強(qiáng)，抑制萃取，最終導(dǎo)致萃取效率明顯降低。所以，在以下的實(shí)驗(yàn)中加入1 M Na2SO4來提高萃取效率。

萃取時(shí)間的選擇。中空纖維支載液膜微萃?。℉F-SLME）是一種平衡萃取技術(shù)。在萃取過程中，增加萃取時(shí)間將使萃取進(jìn)行得更為充分。一般情況下，在達(dá)到萃取平衡之前，隨萃取時(shí)間增長，萃取效率將會增加。Fig.4所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對于被分析的四種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，當(dāng)萃取時(shí)間為60 min時(shí)，萃取效率達(dá)到最大；隨后，進(jìn)一步增加萃取時(shí)間，萃取效率沒有明顯變化。因此，選用60 min作為適宜的萃取時(shí)間。

方法性能評價(jià)和實(shí)際應(yīng)用。設(shè)計(jì)7個(gè)不同濃度水平的目標(biāo)氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，包括線性范圍、相關(guān)系數(shù)、最低檢測限及富集倍數(shù)。在所考察的濃度范圍內(nèi)，每種分析物的濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性（線性回歸系數(shù)R > 0.99）?；?倍信噪比（S/N = 3）得到甲萘威、異炳威、克百威和速滅威最低檢測限分別為0.5，0.8，1.2和1.5 μg/L。平行測定5份5 μg/L氨基甲酸酯農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)樣品，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）小于6%。

為一步評價(jià)本方法的實(shí)用性， 從市場購入番茄、芹菜、大白菜及菠菜四種蔬菜樣品，用本文方法進(jìn)行分析測定。結(jié)果顯示，在所有外購的4種蔬菜樣品中，均未檢出目標(biāo)氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。在實(shí)際樣品中加入5 μg/L氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品獲得的回收率為81 ～ 103%（RSD ≤6.2%），具體如表1所示。

結(jié)論

本研究建立了基于中空纖維支載液膜微萃取-HPLC/DAD聯(lián)用測定蔬菜樣品中四種氨基甲酸酯農(nóng)藥的分析檢測方法。在輔助萃取劑TOPO的協(xié)同作用下，該方法獲得較高的富集倍數(shù)，具有較好的重現(xiàn)性。在幾種實(shí)際樣品中，大部分雖未能檢測到4種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，但在實(shí)際樣品中加入5 μg/L氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，測得的加標(biāo)回收率為81% ～ 103%。同時(shí)，本研究也證明了該方法對基質(zhì)復(fù)雜的蔬菜樣品有較好的凈化作用和選擇性，無需借助其它前處理手段，方便、快速，可以應(yīng)用于各種基質(zhì)復(fù)雜的樣品檢測。

基金項(xiàng)目：湖南省食品藥品監(jiān)督管理局---食品藥品安全科技重點(diǎn)項(xiàng)目（湘食藥科R2015015）。

（作者單位：陶 涌 毛誼平 沈銀梅 任榮軍 歐陽毅 湖南省岳陽市食品藥品檢驗(yàn)所；李鴻程 湖南省岳陽市環(huán)境監(jiān)測中心）