王軍，程萍萍，袁俊英，朱登納，牛國輝，陳靜，杜江華，張冬秀

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

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缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達變化

王軍，程萍萍，袁俊英，朱登納，牛國輝，陳靜，杜江華，張冬秀

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

目的觀察缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達變化。方法70只清潔級7日齡SD大鼠隨機分為A組(50只)、B組(10只)、C組(10只)，A組大鼠采用經(jīng)典Rice法制備HIBD動物模型，B組僅分離而不結扎左側頸總動脈，也不行缺氧處理，C組不作任何處理。A組于HIBD后3、6、12、24、48 h各處死10只，B、C組術后全部即刻處死。比較各組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)。結果與B、C組比較，A組制模后3～48 h凋亡神經(jīng)細胞數(shù)增加，制模后6～48 h Tau蛋白陽性細胞數(shù)增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)增加(P均<0.05)；A組制模后不同時點(3～48 h)凋亡神經(jīng)細胞數(shù)、Tau蛋白陽性細胞數(shù)兩兩比較，制模后不同時點(3～24 h)p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。結論HIBD后新生大鼠腦組織神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡，細胞中Tau、p-Tau蛋白表達升高。

缺氧缺血性腦損傷；神經(jīng)細胞；Tau蛋白；p-Tau蛋白

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)可引起新生兒急慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷，主要原因是誘發(fā)神經(jīng)細胞壞死和凋亡，而細胞凋亡為腦損傷的主要形式[1,2]。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，在神經(jīng)細胞發(fā)育過程中起重要作用[3,4]。正常狀態(tài)下，Tau蛋白有一定程度磷酸化，即p-Tau蛋白，但Tau蛋白過度表達被異常磷酸化、糖基化時對神經(jīng)細胞形態(tài)和功能有直接損傷作用。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧、缺血、外傷等誘導的成年及新生大鼠神經(jīng)損傷過程中，均有Tau、p-Tau蛋白參與。然而，新生大鼠HIBD后腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況及Tau、p-Tau蛋白表達變化，以及兩者間的關系尚不明確。本研究通過建立HIBD模型，觀察HIBD新生大鼠Tau、p-Tau蛋白及神經(jīng)細胞凋亡動態(tài)變化，并對其進行相關性分析，旨在探索神經(jīng)細胞凋亡的相關機制，以此為抗凋亡治療開辟新途徑。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑7日齡清潔級新生健康SD大鼠70只，體質量12～15 g，由河南省實驗動物中心提供。8%O2和92%N2混合氣體(北京普萊克斯公司)；鼠抗Tau單克隆抗體；鼠抗p-Tau單克隆抗體；TUNEL原位細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；SP-0023試劑盒(北京Boosen生物技術有限公司)。

1.2動物分組、HIBD模型制備及標本采集70只大鼠隨機分為A組(50只)、B組(10只)、C組(10只)。A組采用經(jīng)典Rice法[5]制作HIBD動物模型，即新生大鼠以乙醚麻醉，固定于手術臺上，分離并兩端結扎左側頸總動脈，中間剪斷，術后放回母鼠身邊恢復1 h，然后放入常壓缺氧箱，箱內(nèi)有鈉石灰以吸收動物排出的CO2，以1.5 L/min的速度向容器內(nèi)輸入氮氧混合氣體，持續(xù)缺氧2.5 h，術畢放回母鼠身邊飼養(yǎng)。于造模前后觀察每只新生大鼠的意識狀態(tài)和行為能力，如翻身、爬行平衡性、四肢肌張力等。造模成功標準：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)肌力下降，隨意運動靈活性降低，翻身困難或不能，有明顯肢體對稱運動障礙，如夾尾左旋。B組僅分離而不結扎左側頸總動脈，也不行缺氧處理。C組不作任何處理。A組于HIBD后3、6、12、24、48 h各處死10只，B、C組術后即刻處死，取小鼠大腦備檢。

1.3腦組織凋亡神經(jīng)細胞計數(shù)采用TUNEL法。切片常規(guī)脫蠟；梯度乙醇水化；切片浸入新鮮配制的1%Triton X-100通透液中，室溫(15～25 ℃)處理5 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；切片浸入新鮮配制3%H2O2封閉液中，室溫處理10 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制蛋白酶K工作液，100 μL/片，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制TdT酶反應液，置于冰上，濾紙吸干樣本周圍液體，滴加TdT酶反應液，50 μL/片，37 ℃避光孵育1 h，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；新鮮配制streptavidin-FITC工作液，濾紙吸干樣本周圍液體，每個樣本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗3×5 min；新鮮配制POD-conjugated Anti-FITC工作液，濾紙吸干樣本周圍液體，每個樣本滴加50 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗3×5 min；新鮮配制的DAB溶液(淺棕色)，濾紙吸干樣本周圍液體，每個樣本滴加50 μL，室溫顯色，鏡下觀察控制反應時間(勿使背景顏色過深)，PBS緩沖液洗3次，5 min/次；蘇木精輕度復染30 s～1 min，蒸餾水沖洗干凈，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗干凈；脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。染色結束后每個樣品隨機取8張切片，每張切片隨機取8個視野(400×)，分別計數(shù)1.0 mm2內(nèi)TUNEL染色陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.4腦組織Tau、p-Tau蛋白陽性細胞計數(shù)采用免疫組化法。4%多聚甲醛固定30 min；0.2%Triton-X 100室溫通透；3%H2O2室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；10%正常山羊血清室溫封閉非特異性結合位點；加入一抗鼠抗Tau單克隆抗體、鼠抗p-Tau單克隆抗體，設置陰性對照，用PBS代替一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入二抗37 ℃孵育1 h；HE染色；0.1%鹽酸分化；梯度乙醇脫水；透明封片，風干，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及陽性細胞表達情況并攝圖。染色結束后每個樣品隨機取8張切片，每張切片隨機取8個視野(×400)，分別計數(shù)1.0 mm2內(nèi)Tau、p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)，取平均值。

2　結果

各組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)比較見表1。A組制模24 h Tau蛋白陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)呈正相關(r=0.872，P<0.01)。

表1　各組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)及Tau、p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)比較(個

注：與C組比較，△P<0.05；與B組比較，▽P<0.05；A組各指標不同時間點兩兩比較，○P<0.05。

3　討論

HIBD是新生兒常見嚴重疾患，可引起永久性殘疾，發(fā)病率和病死率較高[6]。研究[7]證實，HIBD可引發(fā)神經(jīng)細胞壞死和凋亡，而細胞凋亡為繼發(fā)性腦損傷中神經(jīng)細胞死亡的主要形式，為影響預后的主要因素。因此，對凋亡發(fā)生機理及抗凋亡研究可能為缺氧缺血性腦病的治療開辟新路徑，進而減少或減輕腦損傷后遺癥的發(fā)生。凋亡或程序性細胞死亡是指在一定生理或病理條件下，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由基因調控的細胞自主性死亡[8]，具有特殊形態(tài)學及生物化學特征，包括胞膜皺縮、凹陷及染色質致密、斷裂成小片段和包裹了染色質片段、膜結構尚完整的凋亡小體形成等。新生動物缺氧缺血致腦缺血再灌注，引發(fā)一系列損傷級聯(lián)反應，包括鈣穩(wěn)態(tài)失調、興奮性氨基酸毒性作用、氧化應激損傷、線粒體功能障礙，以及隨后凋亡相關基因、相關蛋白的激活，與此同時，機體釋放大量細胞因子，最終導致了細胞壞死和凋亡。

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，主要生物學功能是促進微管組裝和維持先前形成的微管。正常機體Tau蛋白也有一定程度磷酸化，它在神經(jīng)細胞發(fā)育過程中起主要作用。但Tau蛋白過度表達被異常磷酸化、糖基化時，對神經(jīng)細胞形態(tài)和功能有直接損害。有研究[9]表明，Tau蛋白參與HIBD的病理過程，HIBD后可能通過鈣調蛋白激酶、GSK-3β及興奮性氨基酸谷氨酸受體的共同作用，使Tau蛋白過度磷酸化。過度磷酸化的Tau蛋白構象發(fā)生改變，失去促進微管蛋白聚合能力，導致微管可溶，影響細胞骨架穩(wěn)定性，軸突延伸作用減弱，營養(yǎng)運輸受損，進而導致細胞死亡[10,11]。本研究顯示，與B、C組比較，A組制模后3～48 h凋亡神經(jīng)細胞數(shù)增加；A組制模后不同時點(3～48 h)凋亡神經(jīng)細胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。此結果與文獻[12]報道基本相同。本研究還顯示，與B、C組比較，A組制模后6～48 h Tau蛋白陽性細胞數(shù)增加，制模后3～24 h p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)增加；A組制模后不同時點(3～48 h)Tau蛋白陽性細胞數(shù)兩兩比較，制模后不同時點(3～24 h)p-Tau蛋白陽性細胞數(shù)兩兩比較，P均<0.05。A組制模24 h Tau蛋白陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)呈正相關。推測可能與缺氧缺血后Tau蛋白免疫反應性增強，引起微管解聚及細胞骨架遭到破壞，進而影響神經(jīng)細胞形態(tài)穩(wěn)定及神經(jīng)細胞與神經(jīng)纖維之間的物質運輸，致使神經(jīng)細胞壞死、凋亡以及神經(jīng)纖維退化。

總之，HIBD后新生大鼠腦組織神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡及Tau、p-Tau蛋白表達升高，且Tau蛋白表達與神經(jīng)細胞凋亡存在正相關。

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