王煥，張慧，崔凱，馮衍生

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院)

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慢性腎臟病患者腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化水平觀察

王煥1，張慧2，崔凱1，馮衍生2

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院)

目的觀察慢性腎臟病(CKD)患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平變化，并探討其與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法1～3期CKD患者58例，腎臟穿刺取腎臟組織(CKD組)；腎結(jié)核患者31例，取手術(shù)切除的正常腎臟組織(對照組)。將各組抽提的全基因組DNA分為兩份，一份以15 mmol/L高釕酸鉀、0.05 mol/L氫氧化鈉氧化后，進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化；另一份直接進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。用特異引物進行PCR擴增，焦磷酸測序，檢測羥甲基化并計算其在甲基化中所占比例。分析Klotho基因啟動子羥甲基化水平與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果對照組腎臟組織Klotho基因啟動子羥甲基化修飾；CKD組腎臟組織Klotho基因啟動子甲基化水平高于對照組，羥甲基化水平低于對照組(P均<0.05)。CKD患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系，與腎小管間質(zhì)纖維化面積及肌酐水平呈負相關(guān)。結(jié)論CKD患者腎臟組織中Klotho基因啟動子羥甲基化水平降低，并與CKD臨床病理參數(shù)有關(guān)。Klotho基因啟動子羥甲基化水平下降可能參與了CKD的發(fā)生發(fā)展。

慢性腎臟??；Klotho基因；基因啟動子；羥甲基化

慢性腎臟病(CKD)是指一類在各種致病因子影響下，以腎臟慢性纖維化為病理特征的臨床疾病的總稱，發(fā)病率較高[1]。由于CKD缺乏有效治療手段，最終導(dǎo)致腎功能逐漸惡化，進展為終末期腎病需行腎臟替代治療，嚴重影響患者生活質(zhì)量。研究[2～5]表明，腎臟功能發(fā)生異常多伴隨Klotho表達下降。Klotho基因啟動子甲基化被證明與CKD有關(guān)。但對于Klotho基因啟動子甲基化水平是如何發(fā)生動態(tài)變化、其CpG島甲基化是否還存在其他種類修飾目前尚不清楚。近年研究較多的羥甲基化是一種以5甲基胞嘧啶(5mC)為基礎(chǔ)發(fā)生的氧化去甲基化修飾，被認為是潛在的基因轉(zhuǎn)錄重新激活標志。本研究觀察了CKD患者腎組織中Klotho啟動子羥甲基化水平，并探討其與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2008年7月～2013年7月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺活檢的CKD患者共58例為CKD組，排除糖尿病、自身免疫疾病、腫瘤、乙型肝炎、丙型肝炎及曾使用激素或免疫抑制劑的患者。58例患者中，男28例、女30例，年齡(45.2±12.3)歲，膜性腎病20例、IgA腎病15例、局灶節(jié)段性腎小球硬化10例、新月體腎炎5例、高血壓腎小動脈硬化3例、腎小球輕微病變5例，按照eGFR進行分期1期25例、2期18例、3期15例，腎活檢術(shù)中取病理組織。選擇腎結(jié)核患者31例為對照組，男15例、女16例，年齡(48.5±1.2)歲，取手術(shù)切除的正常腎臟組織。兩組性別、年齡資料有可比性。CKD組eGFR、肌酐水平、腎小管間質(zhì)纖維化面積與對照組相比，P均<0.05。見表1。

表1　兩組患者年齡、eGFR、肌酐及腎小管間質(zhì)纖維化面積比較±s)

注：與對照組相比，*P<0.05。

1.2腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化檢測抽提兩組腎臟組織總DNA 2 μg，分為兩組。氧化組進行15 mmol/L高釕酸鉀、0.05 mol/L氫氧化鈉氧化(BSP)后，進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(oxBS)；未氧化組直接進行oxBS[6]。oxBS后進行PCR擴增，利用Pyro Mark Assay Design2.0軟件設(shè)計引物，上游引物序列為5′-GGGAGTTGGGAGAAATAGG-3′，下游引物序列為5′-CCAACAACACCAACAACA-3′，測序引物序列為5′-GGGAGAGGGGGTGGG-3′，產(chǎn)物長度351 bp。其中上游引物5′端進行生物素標記。擴增所得的PCR產(chǎn)物進行切膠回收，進行焦磷酸測序。氧化組中胞嘧啶會變成胸腺嘧啶，5mC不發(fā)生變化，5羥甲基化胞嘧啶(5hmC)會轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶；未氧化組中5mC、5hmC均不發(fā)生變化，據(jù)此可識別存在羥甲基化修飾的CpG位點。每個CpG位點的甲基化結(jié)果根據(jù)CpG對應(yīng)位點C/T百分比進行分析。0代表胞嘧啶完全羥甲基化，100%代表胞嘧啶完全甲基化[7]。

1.3尿素氮、肌酐水平測定兩組清晨空腹抽取血樣，檢測血清尿素氮、肌酐。根據(jù)MDRD簡化公式計算eGFR[8]。

1.4腎小管間質(zhì)纖維化面積的測算將腎臟組織放于預(yù)先配好的固定液中進行固定，再用低至高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織置于透明劑二甲苯中透明，之后浸蠟包埋，在切片機上進行切片，常規(guī)HE染色。病理結(jié)果根據(jù)盲法原則，由兩位病理醫(yī)師對腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化占皮質(zhì)腎組織面積的百分比進行評價。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟進行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用方差分析；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組腎組織中Klotho基因啟動子甲基化、羥甲基化水平CKD1、2、3組腎組織Klotho基因啟動子甲基化水平高于對照組，且Klotho基因啟動子大部分CpG位點甲基化水平隨著CKD分期增高逐漸升高。對照組腎組織中Klotho基因啟動子-81、-71、-63位點存在羥甲基化修飾；CKD組腎組織Klotho啟動子羥甲基化水平顯著降低，且隨著病情嚴重程度增加，羥甲基化水平逐漸下降，其中在CKD2、3組-81、-71、-63位點BSP與oxBS差異無統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2　各組腎組織Klotho基因啟動子-86～-51位點CpG島羥甲基化水平

2.2CKD患者Klotho啟動子羥甲基化率與臨床病理特征的相關(guān)性CKD患者整體羥甲基化水平與eGFR有關(guān)(F=276.035，P<0.01)，-81位點(R2=0.848，P<0.01)、-71位點(R2=0.885，P<0.01)、-63位點(R2=0.709，P<0.01)羥甲基化水平與eGFR均呈正相關(guān)關(guān)系；CKD患者整體羥甲基化水平與肌酐水平有關(guān)(F=26.796,P<0.01)，-81位點(R2=-0.773，P<0.01)、-71位點(R2=-0.782，P<0.01)、-63位點(R2=-0.728，P<0.01)羥甲基化水平與肌酐水平均呈負相關(guān)關(guān)系；CKD患者整體羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積有關(guān)(F=124.285，P<0.01)，-81位點(R2=-0.887，P<0.01)、-71位點(R2=-0.884，P<0.01)、-63位點(R2=-0.827，P<0.01)羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積均呈負相關(guān)關(guān)系。

3　討論

5mC作為第五種堿基，是DNA水平最常見的表觀遺傳學修飾，其可被甲基化結(jié)合蛋白(MBP)特異性識別，招募轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，通過改變?nèi)旧w構(gòu)象等方式抑制RNA pol聚合酶對啟動子的結(jié)合，最終引起相應(yīng)基因沉默[9]。DNA的去甲基化有很多種方式[10～13]，其中由羥甲基化酶(TET)介導(dǎo)的羥甲基化修飾在合子形成初期的重編程、早期胚胎發(fā)育、干細胞自我更新和分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮重要作用[14]。由于5hmC不被MBP識別，因此并不引起轉(zhuǎn)錄沉默，被普遍認為是基因轉(zhuǎn)錄表達重新激活的標志。目前對5hmC的研究主要集中在全基因組水平，對單基因尤其是某個CpG島或CpG位點的研究很少。本研究采用oxBS結(jié)合常規(guī)BSP的方法，能夠在特定CpG位點水平有效識別并檢測羥甲基化修飾。

Klotho是一個抗衰老基因，其在腎臟、血漿及尿液中水平升高提示腎功能受到影響。此前已有研究表明Klotho基因啟動子甲基化與其表達水平呈負相關(guān)[2]。Klotho基因中存在一些甲基化狀態(tài)保持相對穩(wěn)定的CpG位點，其甲基化水平較高且并不隨腎功能異常而有明顯改變，通過對這些位點進行oxBS分析，能夠反映羥甲基化修飾情況。本研究結(jié)果顯示，CKD組Klotho基因啟動子羥甲基化水平低于對照組，且隨著CKD分期增高而下調(diào)，提示Klotho基因啟動子羥甲基化水平下調(diào)參與了CKD的發(fā)生發(fā)展。由于BSP無法區(qū)分5mC和5hmC，以及5hmC的形成需要5mC作為底物，在低甲基化狀態(tài)中是不存在羥甲基化修飾的，因此可以解釋-81、-71、-63位點始終保持較高的甲基化狀態(tài)。

本研究結(jié)果還顯示，CKD患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系，表明羥甲基化水平會隨著CKD進展而下降，一旦腎功能出現(xiàn)障礙，羥甲基化水平變化幅度較整體甲基化水平變化更為敏感。我們還發(fā)現(xiàn)，Klotho基因羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積及肌酐水平均呈負相關(guān)關(guān)系，提示Klotho基因羥甲基化水平能在一定程度上反映CKD患者腎臟受損情況。

此前有研究認為，CKD患者Klotho基因啟動子發(fā)生超甲基化，同時其表達受到抑制。這種超甲基化的形成一方面是通過對普通胞嘧啶進行甲基化修飾并轉(zhuǎn)化成5mC，這種變化主要發(fā)生在無羥甲基化修飾的CpG位點；另一方面可能是抑制TET酶等功能，阻滯5hmC形成及其后的主動去甲基化過程，這種變化主要發(fā)生在有羥甲基化修飾的CpG位點。我們推測，在正常腎臟組織中，Klotho基因啟動子-81、-71、-63位點羥甲基化修飾同樣有利于Klotho基因的轉(zhuǎn)錄表達，但為何羥甲基化修飾只出現(xiàn)在某些CpG位點，原因仍然未知。

總之，本研究證明正常腎組織Klotho基因啟動子上存在羥甲基化修飾，而CKD患者腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化修飾水平顯著下降。Klotho基因啟動子羥甲基化有望作為一種新的表觀遺傳學標記用于CKD的早期診斷及病情評估。然而，由于腎穿刺活檢取材復(fù)雜，未來是否可以采用其他方法如外周血檢驗來代替腎穿刺活檢尚需進一步研究。對于Klotho基因羥甲基化對CpG位點的偏好性、涉及到哪個TET成員參與羥甲基化修飾作用、治療后Klotho基因啟動子羥甲基化狀態(tài)如何變化，都有待于進一步探索。

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馮衍生(E-mail: 47300725@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.034

R692

B

1002-266X(2016)15-0089-03

2015-09-30)