王成　蔡振寨　周羽翙　鄭繼行　薛戰(zhàn)雄

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·論著·

Latexin基因轉(zhuǎn)染對CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞增殖的影響

王成蔡振寨周羽翙?quán)嵗^行薛戰(zhàn)雄

目的探討Latexin(Lxn)基因?qū)D133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞增殖的影響。方法采用磁珠分選法從MIAPaca-2胰腺癌細胞株中分選出CD133+細胞，在無血清培養(yǎng)基中觀察其形態(tài)變化及種植到裸鼠皮下后的成瘤能力。采用脂質(zhì)體法將不同濃度的插入Lxn基因(1、3、5 μg)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞。應(yīng)用RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染的癌細胞 Lxn mRNA及蛋白表達量。CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染癌細胞的增殖能力。結(jié)果成功分離出CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞，它以懸浮成球的方式生長，以1×105個癌細胞種植裸鼠皮下的成瘤率達100%。轉(zhuǎn)染插入Lxn的質(zhì)粒后，CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞Lxn基因的表達呈轉(zhuǎn)染劑量依賴性地增加，轉(zhuǎn)染5 μg質(zhì)粒的細胞Lxn mRNA 及蛋白表達量分別為20.80±0.98、16.80±2.73，顯著高于未轉(zhuǎn)染細胞的1.02±0.01、1.01±0.01，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；轉(zhuǎn)染后癌細胞增殖活性呈轉(zhuǎn)染劑量及培養(yǎng)時間依賴性地被抑制，轉(zhuǎn)染0.4 μg質(zhì)粒的癌細胞的生長抑制率達36.2%，顯著高于未轉(zhuǎn)染細胞的抑制率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞具有腫瘤干細胞部分特性，Lxn基因轉(zhuǎn)染對CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞增殖具有抑制作用。

胰腺腫瘤；腫瘤干細胞；Lxn基因；抗原，CD133；細胞增殖

Fund program：Natural Science Foundation of Zhenjiang Province(Y2100546)

Latexin(Lxn) 是迄今為止哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一種羧肽酶A抑制劑[1]，由222個氨基酸構(gòu)成。Lxn對血液系統(tǒng)腫瘤、胃癌及肝癌具有抑制作用[2-4]。本課題組曾報道，Lxn在CD133+胰腺癌干細胞中表達較癌細胞顯著下調(diào)[5]，外源性給予Lxn可抑制CD133+胰腺癌干細胞的增殖[6]。本研究進一步將Lxn基因轉(zhuǎn)染CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞，觀察轉(zhuǎn)染后胰腺癌干細胞增殖的變化。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株MIAPaca-2由本實驗室保存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。免疫磁珠(CD133)分選試劑盒購自德國Miltenyi公司，RPMI1640培養(yǎng)基、Lipofecta-mine?2000脂質(zhì)體購自美國Gibco公司，插入Lxn基因片段的質(zhì)粒購自美國Origene公司，兔抗人Lxn多抗(ab103485)購自英國Abcam公司，鼠抗人β-actin單抗、羊抗兔及羊抗鼠IgG、ECL發(fā)光液、BCA蛋白濃度試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)購自美國Fermentas(MBI)公司，熒光實時定量PCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTM)購自日本Takara公司，細胞增殖毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學研究所，胰蛋白酶-EDTA、牛血清白蛋白及牛胰島素購自美國Sigma公司。

二、方法

1．CD133+胰腺癌細胞分選及培養(yǎng)：收集對數(shù)期生長的約2×107個MIAPaca-2細胞重懸于2 ml PBS中，離心去上清后加300 μl PBS重懸，加100 μl FCR blocking reagent、100 μl CD133+磁珠，充分混勻，4℃避光孵育30 min。加2 ml PBS洗滌離心后重懸于1 ml PBS，上預(yù)先用500 ml PBS潤洗過的MS柱，然后用1 ml PBS洗脫，重復(fù)3次。將MS 柱置于15 ml離心管中，加1 ml PBS并用活塞將柱中細胞快速壓出，所得細胞即為CD133+癌細胞，重懸于100 ml PBS中，分成5份接種至10 ml無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。收集洗脫液中CD133-癌細胞，同樣接種至10 ml無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2．裸鼠成瘤實驗：30只4～6周齡的雌性BALB/c nu/nu裸鼠由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于SPF級動物房。實驗分CD133+癌細胞組、CD133-癌細胞組、未分選的MIAPaca-2細胞組，每組10只。分別于裸鼠腋下皮下注射1×104、1 ×105、1×106個上述腫瘤細胞，4周后統(tǒng)計小鼠成瘤情況。

3．Lxn基因轉(zhuǎn)染CD133+癌細胞：收集上述1瓶培養(yǎng)5 d的癌細胞(約106個)，加入1 ml胰蛋白酶-EDTA，輕輕吹打2 min至細胞呈單細胞懸液，加入2 ml完全培養(yǎng)基充分混勻，離心去上清后加2 ml無血清培養(yǎng)基重懸細胞。采用10 cm培養(yǎng)皿，每皿加入無血清培養(yǎng)基8 ml，細胞懸液200 μl，約105個細胞，常規(guī)培養(yǎng)2 d。取4只1.5 ml EP管分別加入250 μl無血清培養(yǎng)基及0、1、3、5 μg 插入Lxn片段的質(zhì)粒混勻(A液)，室溫放置5 min，再取4只1.5 ml EP管分別加入250 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl脂質(zhì)體混勻(B液)，室溫放置5 min。將B液分別加入A液中混勻，室溫靜置20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別均勻緩慢滴加到4只待轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4．癌細胞Lxn mRNA表達檢測：收集轉(zhuǎn)染的CD133+癌細胞，采用Trizol裂解液提取細胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光實時定量PCR試劑盒在Roche LightCycle480熒光定量PCR儀行實時PCR檢測。Lxn引物序列上游為5′-GAAGGTCAAACAAGCCAGCA-3′，下游為5′-AACCCAGGCTAAATGTAGAACG-3′；內(nèi)參β-actin引物序列上游為5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游為5′-AAGAAAGGGTGTAACGCAACTAAG-3′，引物序列由美國Invitrogen公司合成。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s，45個循環(huán)。由儀器自帶軟件獲取Ct值，按公式2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。實驗重復(fù)3次，取均值。

5．癌細胞Lxn蛋白表達檢測：用RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染的CD133+癌細胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測Lxn蛋白表達量。兔抗人Lxn多抗、鼠抗人β-actin單抗工作濃度分別為1∶500、1∶1 000，羊抗鼠、羊抗兔IgG工作濃度均為1∶50 000。最后ECL發(fā)光、X膠片曝光、顯影、定影，AlphaEaseFC掃描分析軟件系統(tǒng)檢測條帶灰度值。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取均值。

6．癌細胞增殖抑制率檢測：采用CCK-8法檢測細胞增殖。96孔板每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基，同時加入3×103個CD133+胰腺癌細胞，培養(yǎng)2 d后采用上述的脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染Lxn，加入的插入Lxn片段質(zhì)粒的濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4 μg，同時設(shè)置單加等容積無菌PBS的空白組，每組6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后每孔加入10 μl CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。上酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔在波長450 nm處的吸光值(A450值)。細胞增殖抑制率(%)= [(A對照孔-A實驗孔)/A對照孔]×100% 。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一、CD133+MIAPaca-2細胞及CD133-MIAPaca-2細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)變化

CD133+MIAPaca-2細胞以懸浮成球的方式生長，培養(yǎng)7 d時存活良好；CD133-MIAPaca-2細胞呈貼壁生長，大部分在培養(yǎng)2 d內(nèi)死亡。CD133+MIAPaca-2細胞培養(yǎng)第1天有少量細胞貼壁，部分細胞死亡，多數(shù)細胞開始分裂；第2天開始有較小細胞球形成，形態(tài)較粗糙，貼壁的細胞出現(xiàn)死亡；第5～7天時細胞形成較圓潤的球形，周圍透光度高，中間透光度低(圖1)。

二、裸鼠成瘤率

皮下注射1×104個CD133+細胞的成瘤率為90%，注射1×105個以上細胞的成瘤率達100%；皮下注射1×104、1×105個CD133-癌細胞均未成瘤，注射1×106個癌細胞的成瘤率為40%；皮下注射1×104、1×105、1×106個未分選MIAPaca-2細胞的成瘤率分別為0、40%、100%。CD133-癌細胞的成瘤率明顯下降。

圖1　CD133+MIAPaca-2細胞在無血清培養(yǎng)基中生長1～6 d的形態(tài)變化(1A～1F　×200)

三、CD133+MIAPaca-2細胞Lxn mRNA表達

未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染1、3、5 μg插入Lxn片段質(zhì)粒的CD133+MIAPaca-2細胞的Lxn mRNA表達量分別為1.02±0.01、3.53±0.32、8.10±0.61、20.80±0.98；Lxn蛋白表達量分別為1.01±0.01、2.81±0.23、7.12±1.12、16.80±2.73(圖2)。轉(zhuǎn)染細胞的表達量均顯著高于未轉(zhuǎn)染細胞，且隨質(zhì)粒濃度的增加而增加(F值分別為659.5、102.8，P值均<0.05)。

圖2　未轉(zhuǎn)染(1)及轉(zhuǎn)染1、3、5 μg(2、3、4)插入Lxn片段質(zhì)粒的CD133+MIAPaca-2細胞的Lxn蛋白表達(蛋白質(zhì)印跡法)

四、CD133+MIAPaca-2細胞的增殖抑制

CD133+MIAPaca-2細胞增殖的抑制率隨著轉(zhuǎn)染插入Lxn片段質(zhì)粒的濃度及培養(yǎng)時間的延長而增加(圖3、表1)。

圖3　不同濃度質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后CD133+MIAPaca-2細胞的生長抑制率

討　　論

由于胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生早，通常在診斷時已經(jīng)是晚期，其中位生存期4～6個月，5年生存率1%～4%，預(yù)后較差[7-8]。近年來研究顯示，腫瘤細胞中存在一群含量極少但卻具有干細胞性質(zhì)的特殊細胞群,稱之為腫瘤干樣細胞或腫瘤干細胞[9-10]。腫瘤干細胞是腫瘤細胞中一個同正常干細胞一樣具有自我更新和分化能力的亞群， 所占比例低，但恰是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。因此靶向腫瘤干細胞的治療為胰腺癌的治療提供了新的思路。2007年Li等[11]首先將CD44、CD24、ESA作為特異性干細胞表面標志物分離出具有高度致瘤性的胰腺癌干細胞，占胰腺癌細胞的0.2%～0.8%，但其成瘤能力是其他腫瘤細胞的100倍，具有自我更新、分化等干細胞特性。以后有報道CD133、CXCR4及c-Met等也可作為胰腺癌干細胞的標志物[12-13]。但目前研究發(fā)現(xiàn)的胰腺癌干細胞標志物的特異性均不高，且與他腫瘤干細胞存在交叉或部分存在于正常細胞中。多個研究報道，CD133+胰腺癌細胞具有部分干細胞特性，可稱為腫瘤干細胞樣細胞[12,14-16]。本研究利用磁珠分選技術(shù)獲得CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞，在無血清培養(yǎng)基生長良好，呈球狀；體內(nèi)成瘤實驗顯示其成瘤率高，說明其具有自我更新能力，具有部分干細胞特性。

Lxn對腫瘤細胞的生長抑制作用首先在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中被關(guān)注。多種白血病、淋巴瘤細胞系以及惡性黑色素瘤患者的Lxn表達減少或缺如[2]。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中Lxn啟動子常異常甲基化，去甲基化處理可使Lxn表達重新激活，它通過增加細胞凋亡而抑制腫瘤細胞生長。近期報道[3-4]，Lxn在胃癌及肝癌組織中表達下調(diào)，通過過表達或敲除Lxn基因等方法能夠達到抑制或促進腫瘤細胞的生長。本課題組曾報道，CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞Lxn基因表達明顯低于CD133-MIAPaca-2細胞；細胞毒性試驗顯示Lxn能抑制CD133+MIAPaca-2細胞增殖，且抑制率呈現(xiàn)時間和濃度依賴性[6]。De Haan等報道，Lxn是小鼠造血干細胞數(shù)量的負調(diào)節(jié)因子，Lxn基因參與成體干細胞的生長調(diào)控，并且與干細胞的衰老密切相關(guān)[17]，因此推測Lxn可能參與胰腺癌干細胞的生長調(diào)控。本實驗采用基因轉(zhuǎn)染方法使CD133+MIAPaca-2細胞Lxn基因過表達，結(jié)果顯示Lxn過表達能抑制CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞的增殖，且呈現(xiàn)時間及轉(zhuǎn)染劑量依賴性。

總之，本研究結(jié)果證實CD133+MIAPaca-2胰腺癌細胞具有部分干細胞特性，Lxn基因過表達能抑制CD133+MIAPaca-2胰腺癌干細胞樣細胞的增殖，可能是胰腺癌基因治療潛在靶點。

表1　不同濃度質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的CD133+MIAPaca-2細胞的增殖抑制情況

注：與未轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05；與同濃度24 h點比較，bP<0.05

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(本文編輯：呂芳萍)

Effect of Latexin gene transfection on proliferation in CD133+MIAPaca-2 pancreatic cancer stem like cells

WangCheng,CaiZhenzhai,ZhouYuhui,ZhengJihang,XueZhanxiong.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

Correspondingauthor:XueZhanxiong,Email:czz77@sina.com

ObjectiveTo explore the effect of Latexin (Lxn) gene transfection on proliferation of CD133+MIAPaca-2 pancreatic cancer stem-like cells. MethodsCD133+MIAPaca-2 cells were isolated and sorted by magnetic activated cell sorting from pancreatic cancer MIAPaca-2 cell line. CD133+MIAPaca-2 cells were cultured in serum-free medium and the capacity for proliferation, and tumorigenicity of CD133+MIAPaca-2 cells was determined by the floating spheres test and tumor xenograft assays. The CD133+MIAPaca-2 cells were transfected with Lxn plasmid (1, 3, 5 μg). After transfection, the protein and mRNA expression of Lxn in CD133+and CD133-MIAPaca-2 cells were detected by Western blotting and RT-PCR, respectively. Cell proliferation was assayed by CCK-8. ResultsCD133+MIAPaca-2 cells were successfully isolated, and it grew into a ball-suspended way, the tumorigenicity rate in nude mice with subcutaneous injection 1×105cancer cells was 100%. After Lxn plasmid transfection, the expression of Lxn in CD133+MIAPaca-2 cells was increased in a dose dependent manner, the Lxn protein and mRNA expression of tumor cells transfected with 5 μg plasmid was 20.80±0.98, 16.80±2.73, which was significantly higher than that in non-transfected cells (1.02±0.01, 1.01±0.01), and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). After transfection, cellular proliferation activity also showed a transfection dose and culture time-dependent decrease,the inhibition rate of tumor cells transfected with 0.4 μg plasmid was 36.2%, which was significantly different from that in non-transfected cells (P<0.05). ConclusionsCD133+MIAPaca-2 pancreatic cancer cells have some characteristics of cancer stem cells. Lxn gene transfection can inhibit the proliferation of CD133+MIAPaca-2 cells.

Pancreatic neoplasms；Neoplastic stem cells；Latexin gene；Antigens, CD133；Cell proliferation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.003

325000浙江溫州，溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化科(王成現(xiàn)在寧波市第二醫(yī)院普外科)

薛戰(zhàn)雄，Email：czz77@sina.com

浙江省自然科學基金(Y2100546)

2015-03-12)