羅　娜，董　文，何春秋，薛姝雯，李　晶，陳富林，，馬艷玲

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069；2.西安市油田微生物工程實驗室，陜西西安710069）

銅綠假單胞菌XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的優(yōu)化培養(yǎng)及其穩(wěn)定性

羅娜1，董文1，何春秋1，薛姝雯2，李晶2，陳富林1，2，馬艷玲1

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710069；2.西安市油田微生物工程實驗室，陜西西安710069）

以1株從原油污染樣品中分離獲得的銅綠假單胞菌XJ601為研究對象，采用蒽酮比色法定量分析鼠李糖脂，優(yōu)化其產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基組成。研究表明:疏水性底物優(yōu)于親水性底物，具有更高的鼠李糖脂產(chǎn)量，尤以菜籽油最佳；氮源中，硝酸鹽、NH4Cl能促進鼠李糖脂的合成，以菜籽油為碳源時，最佳氮源為NaNO3；C/N比值在20時，鼠李糖脂產(chǎn)量最高；P元素的微量添加會影響鼠李糖脂的合成。搖瓶培養(yǎng)獲得的鼠李糖脂對不同溫度、pH及NaCl濃度都具有較好的穩(wěn)定性，表明其在三次采油及原油污染生物治理等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:銅綠假單胞菌；鼠李糖脂；優(yōu)化培養(yǎng)基；穩(wěn)定性；定量分析

生物表面活性劑是微生物產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，它既有與化學(xué)表面活性劑相同的能高效起泡、高效破乳、對特定界面具有選擇性等特點，還具有生物或非生物毒性低、易于被微生物降解、結(jié)構(gòu)多樣等獨特特點，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、油田、化妝品及環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景［1-2］。鼠李糖脂是目前研究深入且應(yīng)用最為廣泛的生物表面活性劑，尤其在石油開采的過程中，常常通過添加微生物發(fā)酵產(chǎn)生的鼠李糖脂來達到降低水原油巖石之間界面張力的目的，這是近年來常用的提高原油采收率的方法［3-4］。在美國阿拉斯加發(fā)生的Exxon Valdez號油輪溢油事件中，通過添加生物表面活性劑來治理溢出油，在6周的時間內(nèi)，石油中全部的正烷烴幾乎被全部降解［5］。因此，鼠李糖脂生物表面活性劑的生產(chǎn)受到了廣泛關(guān)注，研究能夠使得微生物高效合成鼠李糖脂的方法將帶來重要的社會和經(jīng)濟效益。

微生物合成鼠李糖脂的過程受到菌種本身、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間等因素的影響，特別是培養(yǎng)基的組成［6］。目前，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是發(fā)酵產(chǎn)生鼠李糖脂應(yīng)用最廣泛的菌株之一，因為它可利用多種碳源合成鼠李糖脂。Zhu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，以大豆油為唯一碳源和能源，在5 L體積的發(fā)酵罐中發(fā)酵鼠李糖脂，通過兩階段調(diào)控pH的方法，鼠李糖脂的產(chǎn)量可高達70.56 g/L。然而，添加不同親、疏水性質(zhì)的碳源底物，產(chǎn)生的鼠李糖脂及其副產(chǎn)物β-羥基脂酰-ACP（PHA）和β-羥基烷酰基β-羥基烷酸（HAA）的組成比例也有所不同，同時也會影響發(fā)酵產(chǎn)物的表面活性和乳化性能［8］。不僅碳源的種類會影響鼠李糖脂的生物合成，培養(yǎng)基中的氮源、C/N比、P和S等也有重要的影響。由此可見，正確權(quán)衡發(fā)酵原料中底物的特異性、發(fā)酵產(chǎn)物的表面活性組成成分以及產(chǎn)物生產(chǎn)量的穩(wěn)定性，是利用微生物產(chǎn)生鼠李糖脂的研究重點。

筆者以1株從油井采出液中分離出的、能高效降解原油且能產(chǎn)生鼠李糖脂的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）XJ601為研究對象，研究不同碳源、氮源、C/N比、磷源對該菌產(chǎn)鼠李糖脂的影響，通過優(yōu)化培養(yǎng)基各成分比來提高鼠李糖脂的產(chǎn)量，以期為鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1出發(fā)菌株

銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）XJ601，由本實驗室成員從新疆油田油井采出液中分離純化并鑒定。

1.1.2培養(yǎng)基

實驗所用培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基和BPLM培養(yǎng)基，根據(jù)不同實驗需求適當(dāng)調(diào)整［9-10］。除有特殊要求的配制外，配制時都用蒸餾水定容至1 L，121℃高溫濕熱滅菌20 min，當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖時，115℃高溫濕熱滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基:每1 L中含蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、NaCl 5.00 g；pH 7.0～7.2。若需要固體培養(yǎng)基時，每升加入13～15 g瓊脂粉。

BPLM無機鹽培養(yǎng)基:每1 L中含5 mL磷酸鹽緩沖液（每1 L中含K2HPO4·3H2O 25.82 g、KH2PO48.70 g、Na2HPO4·12H2O 33.40 g、NH4Cl 5.00 g）、3 mL 22.50 g/L MgSO4溶液、1 mL 36.40 g/L CaCl2溶液、1.0 mL 0.25 g/L FeCl3溶液、1 mL微量元素溶液（39.90 mg/L MnSO4、42.80 mg/L ZnSO4·H2O、34.70 mg/L（NH4）7MoO24·4H2O）。

1.1.3試劑

H2SO4-蒽酮溶液（100 mL）:分析純H2SO4（98%）稀釋至85%，加入0.2 g蒽酮，攪拌至蒽酮溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2實驗方法

1.2.1菌株活化和富集

將菌株XJ601劃至新鮮的固體LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，挑取單克隆于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h。4℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌水將菌體重懸，作為種子液備用。

1.2.2不同碳源對菌株XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以菜籽油、豆油、甘油、檸檬酸鈉、熒蒽、正辛烷為唯一碳源和能源，搖瓶發(fā)酵后定量分析發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.3不同氮源對菌株XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取菜籽油為唯一碳源和能源，分別以NaNO3、NH4Cl、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、氨水（NH3·H2O）作為氮源，搖瓶發(fā)酵后定量分析發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.4C/N比對菌株XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取上述獲得的最佳碳源及最佳氮源設(shè)置C/N比，分別為2、6、10、15、20、25，搖瓶發(fā)酵后定量分析發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.5磷源對菌株XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以優(yōu)化后的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加或不加磷源，搖瓶發(fā)酵后定量分析發(fā)酵液中鼠李糖脂的含量。

1.2.6鼠李糖脂的提取及定量分析

取200 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，棄菌體，收集上清，將pH調(diào)至2，量取發(fā)酵液的體積，按照V（發(fā)酵液）∶V（氯仿）∶V（甲醇）=3∶2∶1的比例加入氯仿和甲醇，磁力攪拌器混勻10 min，8 000 r/min離心10 min，吸取下層氯仿層，烘干，計算質(zhì)量差。

將發(fā)酵液稀釋500倍，取1 mL至玻璃試管，同時取1 mL蒸餾水至另一個玻璃試管作為對照，將2支試管置于冰水混合物中冰浴3 min，取出立即加入蒽酮-H2SO4試劑，用力振蕩試管搖勻，沸水浴5 min，至顯色，取出冷卻至室溫，在620 nm處測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算鼠李糖脂的含量。

1.2.7鼠李糖脂臨界膠束濃度（CMC）的測定

表面活性劑締合成為膠束時的最低濃度稱為表面活性劑的臨界膠束濃度（CMC）［11］。本研究通過梯度稀釋將表面活性劑稀釋成不同的濃度，通過測定表面張力的方法測定了XJ601菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂的CMC，同時測定了化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的CMC，作圖比較鼠李糖脂與SDS的乳化性能。

1.2.8不同因素對鼠李糖脂穩(wěn)定性的影響

配制一定CMC濃度的鼠李糖脂（90 mg/L）和SDS（900 mg/L）溶液，分別在不同的溫度、pH時處理2 h，利用表面張力儀測定表面張力，通過表面張力的變化和高低來比較鼠李糖脂和SDS在不同溫度和酸堿度下的穩(wěn)定性。在一定CMC濃度下的鼠李糖脂和SDS溶液中加入NaCl使其達到不同的終濃度，同樣測定其表面張力，從而比較不同NaCl濃度下鼠李糖脂和SDS的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與討論

2.1BPLM培養(yǎng)基的優(yōu)化

以BPLM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察6種碳源、8種無機氮源對細胞生長和鼠李糖脂生產(chǎn)的影響。在培養(yǎng)基中添加不同碳源，考察其對細胞生長和鼠李糖脂生產(chǎn)的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知:菌株XJ601可利用多種碳源合成鼠李糖脂，菜籽油優(yōu)于豆油、甘油、檸檬酸鈉、熒蒽、正辛烷，是優(yōu)選的較廉價碳源，具有更高的鼠李糖脂產(chǎn)量。

圖1　碳源對XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.1 Effects of different carbon source on rhamnolipid production by strain XJ601

培養(yǎng)基中添加不同的氮源對鼠李糖脂產(chǎn)量也有顯著影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知:硝酸鹽、NH4Cl等氮源能作為激活劑促進微生物對鼠李糖脂的合成，而氨水、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸等氮源則作為抑制劑抑制鼠李糖脂的合成。這是因為好氧微生物利用氮源時經(jīng)硝化作用脫氮，將硝酸鹽還原為分子氮或NO2，厭氧微生物經(jīng)反硝化作用脫氮，將銨鹽氧化為硝酸鹽［12］。而銅綠假單胞菌為專性需氧菌，因此容易利用硝酸鹽，因而以硝酸鹽為氮源時鼠李糖脂的產(chǎn)量更高。

圖2　氮源對XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.2 Effects of different nitrogen source on rhamnolipid production by strain XJ601

不僅碳源和氮源的種類影響鼠李糖脂的生物合成，C/N比值也有重要的影響，因此也考察了C/N比值對鼠李糖脂生物合成的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)C/N比值為20時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最高。

綜上可知，菜籽油及NaNO3分別為最佳的碳、氮源，而最佳的C/N比值為20，此時鼠李糖脂產(chǎn)量最高。

圖3　碳氮比對XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.3 Effects of different C/N ratio on rhamnolipid production by strain XJ601

2.2優(yōu)化前后細胞生長和鼠李糖脂產(chǎn)量的比較

對BPLM培養(yǎng)基進行優(yōu)化前后的搖瓶平行培養(yǎng)，測定細胞密度和鼠李糖脂的產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:當(dāng)用優(yōu)化前的培養(yǎng)基發(fā)酵XJ601菌株時，鼠李糖脂的產(chǎn)量為14.08 g/L；用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵時，鼠李糖脂的產(chǎn)量為24.99 g/L。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的量是優(yōu)化前的1.78倍。就生物量曲線來看，用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵時，生物量也較優(yōu)化前的略高。由此可見，優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及配比更適合銅綠假單胞菌XJ601菌株生長和其次級代謝產(chǎn)物——鼠李糖脂的合成和分泌。優(yōu)化后的BPLM培養(yǎng)基與優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比較，最大的特點是將前者培養(yǎng)基成分中的NH4Cl替換成了NaNO3。

圖4　培養(yǎng)基優(yōu)化前后XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的量比較Fig.4 Comparison of rhamnolipid productivity by strain XJ601 before and after medium components optimization

2.3磷源對XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的影響

磷源在培養(yǎng)基中不僅作為調(diào)節(jié)培養(yǎng)基環(huán)境的緩沖液，同時為細菌的核酸合成及其他代謝活動等提供磷元素，或作為相關(guān)基因表達的調(diào)控因子。Reis等［12］研究發(fā)現(xiàn)，磷源的添加可上調(diào)銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)（quorum sensing system）中rhlR基因的表達，從而影響鼠李糖脂的產(chǎn)量。因此，進一步考察磷源的添加對XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:培養(yǎng)基中不添加磷源時，XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的量為12.93 g/L；BPLM培養(yǎng)基中正常加入了合適的磷源，XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的量為15.40 g/L；而當(dāng)加入0.001 g/L的磷源，制造一個磷限制的環(huán)境，XJ601菌株產(chǎn)鼠李糖脂的量為21.98 g/L。由此可見，無磷環(huán)境中，由于核酸等物質(zhì)不能順利合成，需從其他補給途徑合成，因此鼠李糖脂的產(chǎn)量和生物量都較磷限制環(huán)境和BPLM環(huán)境中低，而低磷濃度提高了鼠李糖脂產(chǎn)生相關(guān)基因rhlR基因的表達，增加了鼠李糖脂的產(chǎn)量。由于磷限制環(huán)境不僅提高了鼠李糖脂的產(chǎn)量，同時也激活了phzA1和phzA2等毒力因子的表達，增加了綠膿菌素等有害次級代謝產(chǎn)物的量，因此利用磷限制環(huán)境提高鼠李糖脂產(chǎn)量的方法在工業(yè)上還不能大規(guī)模使用，需進一步探究。

圖5　磷源對XJ601產(chǎn)鼠李糖脂的影響Fig.5 Effects of different phosphorus source on rhamnolipid production by strain XJ601

2.4鼠李糖脂與SDS的臨界膠束濃度（CMC）比較

CMC是衡量表面活性劑活性大小常用的重要指標(biāo)。CMC的數(shù)值越小，表示此種表面活性劑在較低的濃度時就能形成膠團，達到表（界）面的飽合吸附，改變液體表面或界面性質(zhì)所需的表面活性劑濃度越低。本實驗通過將化學(xué)表面活性劑SDS和生物表面活性劑鼠李糖脂稀釋成不同的濃度，分別測定表面張力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知:在10～1 000 mg/L時，SDS的質(zhì)量濃度達到900 mg/L時，繼續(xù)增加SDS的濃度，表面張力才趨于穩(wěn)定；而鼠李糖脂的質(zhì)量濃度達到90 mg/L時，繼續(xù)增高鼠李糖脂的濃度，表面張力就已趨于穩(wěn)定。即化學(xué)表面活性劑SDS的CMC為900 mg/L，生物表面活性劑鼠李糖脂的CMC為90 mg/L，這表明XJ601菌株產(chǎn)生的鼠李糖脂的乳化性能比化學(xué)合成的表面活性劑SDS的乳化性能高10倍。

圖6　SDS與鼠李糖脂的CMC比較Fig.6 CMC comparison of SDS and rhamnolipids

2.5不同環(huán)境因素對鼠李糖脂穩(wěn)定性的影響比較

通過改變溫度、pH及NaCl濃度測定表面活性劑的表面張力，以化學(xué)表面活性劑SDS為參照，研究鼠李糖脂的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。由圖7（a）可知:在10～90℃處理鼠李糖脂時，鼠李糖脂溶液的表面張力均較為穩(wěn)定，保持在24.4 mN/m左右基本不變；在-20～10℃和100～120℃時處理鼠李糖脂時，鼠李糖脂溶液的表面張力會有略微的波動，但依然相對穩(wěn)定，保持在25.3 mN/m左右。由圖7（b）可知:當(dāng)pH處于3～11時，鼠李糖脂的表面活性基本沒有影響，表面張力為24.5 mN/m；當(dāng)pH大于11時，其表面張力逐漸升高，繼續(xù)調(diào)高pH會產(chǎn)生絮狀沉淀；而在強酸性的環(huán)境中，鼠李糖脂則較為穩(wěn)定。由圖7（c）可知:當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度在25 g/L的范圍內(nèi)，鼠李糖脂的表面張力基本穩(wěn)定不變，其表面張力為25.1 mN/m；隨著鹽濃度的增加，其表面張力會有略微的波動。由圖7可以看出，無論是在較極端的酸堿環(huán)境、溫度或鹽度環(huán)境下，鼠李糖脂都比較穩(wěn)定，而SDS波動都明顯較大，鼠李糖脂比SDS更能耐受極端環(huán)境，也更能適應(yīng)油田多變的環(huán)境。

3　結(jié)論

油田中分離出的菌株XJ601能夠高效降解原油且能產(chǎn)生和分泌生物表面活性劑——鼠李糖脂，因而能夠促進原油在水溶液中的乳化。將初始選用的BPLM培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，鼠李糖脂的產(chǎn)量與沒有優(yōu)化的培養(yǎng)基發(fā)酵相比提高了1.78倍，鼠李糖脂的CMC也比SDS低10倍，具有更好的乳化和增溶能力。與化學(xué)表面活性劑SDS相比，在高溫、高鹽、強酸、強堿等條件下，銅綠假單胞菌菌株XJ601合成的鼠李糖脂都有更好的穩(wěn)定性，也更能適應(yīng)油田多變的環(huán)境。

圖7　環(huán)境因素對鼠李糖脂穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of different conditions on the stability of rhamnolipids

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（責(zé)任編輯 荀志金）

Effects of medium components on rhamnolipid production and its stability by Pseudomonas aeruginosa XJ601

LUO Na1，DONG Wen1，HE Chunqiu1，XUE Shuwen2，LI Jing2，CHEN Fulin1，2，MA Yanling1
（1.College of Life Science，Northwest University，Xi′an 710069，China；2.Oil Field Microbial Engineering Laboratory，Xi′an 710069，China）

The present work aims to investigate the effects of different medium components on rhamnolipid production by anthrone colorimetry quantitative analysis with Pseudomonas aeruginosa strain XJ601，which was isolated from crude oil-contaminated sample.The results showed that water-soluble and waterinsoluble carbon sources had been utilized forwere used to productione of rhamnolipids，while carbon sources such as vegetable oils were especially effective to produce rhamnolipid.With rapeseed oil as corbon source，nitrate was better than ammonium chloride as nitrogen source to enhance the production of rhamnolipids.Not only the type of carbon and nitrogen source but also the C/N ratio strongly influenced total rhamnolipid productivity，the highest final rhamnolipid concentration was observed at a C/N ratio of 20.The addition of P was also effective on the biosynthesis of rhamnolipids.The product of rhamnolipids by shake flask culture had good stability at different temperature and pH and different concentration of NaCl，which suggested that rhamnolipids produced by this strain hold much promise for oil recovery operations as well as for oil spill bioremediation.

Pseudomonas aeruginosa；rhamnolipid；optimization of medium components；stability；quantitative analysis

Q93

A

1672-3678（2016）03-0075-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.014

2016-01-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2013AA064402）；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目（15JF032）

羅 娜（1990—），女，甘肅張掖人，研究方向:環(huán)境微生物；馬艷玲（聯(lián)系人），副教授，E-mail:mayanling@nwu.edu.cn