左肖肖，陸利霞，2，李　壹，2，熊曉輝，2

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800；2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇南京211800）

微生物高密度培養(yǎng)策略

左肖肖1，陸利霞1，2，李壹1，2，熊曉輝1，2

（1.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800；
2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇南京211800）

微生物高密度培養(yǎng)具有發(fā)酵周期短、生產(chǎn)率高、成本低等優(yōu)點，已成為發(fā)酵工程領(lǐng)域的研究重點。筆者從營養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境因素、補料方式及反應(yīng)器、代謝調(diào)控策略等方面分析如何提高微生物發(fā)酵密度效果，表明微生物高密度發(fā)酵必須從菌體本身、代謝特點、營養(yǎng)需求等多角度、綜合設(shè)計才更有效，便于降低發(fā)酵成本。

高密度培養(yǎng)；生物反應(yīng)器；代謝調(diào)控

微生物的高密度培養(yǎng)以低成本獲得高生產(chǎn)率和高產(chǎn)品效益，已成為食品、藥品等方面的研究熱點。微生物采油將微生物及其營養(yǎng)物注入地下油層，使其在油層中繁殖代謝，利用微生物對原油作用及其代謝產(chǎn)物來提高原油采收率。由于油層孔隙體積一般高達幾百萬立方米，為提高增油效果，現(xiàn)場需要注入大量的微生物菌體培養(yǎng)物。在工業(yè)化生產(chǎn)中，保證生產(chǎn)效果的同時必須控制投入成本。因此，低成本、高效率的高密度培養(yǎng)技術(shù)有望大幅降低微生物培養(yǎng)液的成本，在微生物采油領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。高密度培養(yǎng)（high celldensity culture，HCDC），一般是指微生物在液體培養(yǎng)中，細胞群體密度超過常規(guī)細胞10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)狀態(tài)［1］。高密度培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)相比，優(yōu)點如下［2］:1）實現(xiàn)微生物的高密度和高生產(chǎn)率；2）可使生物反應(yīng)器的體積縮小，過程更加安全；3）簡化下游產(chǎn)物的分離純化步驟；4）縮短發(fā)酵周期，實現(xiàn)產(chǎn)物的高效價；5）減少設(shè)備投資，縮小成本。高密度培養(yǎng)技術(shù)也可用于工程菌發(fā)酵，以盡可能低的成本實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)［3］。

影響高密度培養(yǎng)的因素包括營養(yǎng)物質(zhì)種類、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式、生物反應(yīng)器的選擇以及培養(yǎng)體系等，本文就微生物高密度培養(yǎng)策略進行綜述。

1　營養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)化策略

碳源、氮源、無機鹽、生長因子等是細胞生長所必需的營養(yǎng)成分，在高密度培養(yǎng)時，這些營養(yǎng)成分必須比例恰當(dāng)，且濃度不會抑制細胞的生長［4］。

碳源是微生物培養(yǎng)基的關(guān)鍵組成部分，主要為微生物或細胞的正常生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而不同的碳源種類和濃度對生物量有不同的影響。郭漢卿等［5］通過對石油開采功能菌株瓊氏不動桿菌5-6高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以葵花籽油作為碳源時，明顯優(yōu)于其他幾種碳源，菌密度高達1.2×109CFU/mL，較優(yōu)化前基礎(chǔ)培養(yǎng)基的6.0×108CFU/mL提高了2倍。Posada-Uribe等［6］在研究培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對枯草芽胞桿菌EA CB0575產(chǎn)芽胞的影響中發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)的碳源是葡萄糖，最佳無機鹽為MgSO4·7H2O。整體優(yōu)化后得到的芽胞數(shù)為8.78× 109CFU/mL，芽胞率為94.2%，芽胞數(shù)量和芽胞率分別提高了17.2倍和1.9倍。

氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮化合物的基礎(chǔ)，在微生物生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物過程中起著至關(guān)重要的作用，最常用的氮源是有機氮源。但是，微生物利用不同氮源，其相應(yīng)的產(chǎn)物和菌密度差別較大。Fei等［7］利用葡萄糖和木糖作為碳源，高密度培養(yǎng)一種工程紅球菌屬菌株，發(fā)現(xiàn)當(dāng)（NH4）2SO4作為氮源時，OD600為28.8±1.3，其他無機氮源的OD也比有機氮源的高，脂質(zhì)濃度和脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)都達到最大，分別為（4.05±0.66）g/L和44.3%，脂質(zhì)的最高產(chǎn)量為0.137 g/g。這與文獻［8］報道的用葡萄糖作為碳源的結(jié)果一致，這說明葡萄糖和木糖作為混合碳源時，選擇（NH4）2SO4作為氮源最佳。

無機鹽是許多微生物生長不可缺少的營養(yǎng)元素，主要是構(gòu)成菌體的細胞成分，作為酶的激活劑或者抑制劑。常用的無機鹽有磷酸鹽、鎂鹽、鐵鹽及鉀鹽等。臧超群等［9］通過對生防細菌SY286發(fā)酵條件優(yōu)化，得出以NaCl作為無機鹽時，生防細菌SY286菌懸液密度和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的活性均最大，分別為1.5×109CFU/mL和92.37%，明顯優(yōu)于MgSO4、ZnSO4等其他幾種無機鹽，因此選擇NaCl作為最佳無機鹽。

因此，選擇營養(yǎng)物質(zhì)時需要分析菌體代謝及產(chǎn)物特點、原料供應(yīng)優(yōu)勢等，使微生物細胞快速生長，以提高菌體密度，這也是解決高密度培養(yǎng)問題的策略之一。

2　培養(yǎng)條件

溫度主要是通過改變酶的反應(yīng)速度來控制微生物的生長。選擇適宜的培養(yǎng)溫度對菌體的濃度和產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。王西祥等［10］在響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽胞桿菌NS178產(chǎn)芽胞發(fā)酵工藝中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為33℃時，NS178發(fā)酵液菌落密度為3.45×109CFU/mL，是優(yōu)化前的7倍左右。周斌等［11］在重組菌肝素黃桿菌高密度生產(chǎn)肝素酶Ⅱ中發(fā)現(xiàn)，只有在37℃條件下最終OD600可以達到98，酶活可以高達9 436 U/L。

pH是影響高密度培養(yǎng)的重要因素之一。目前大多數(shù)的研究都是針對起始pH對生物量和代謝產(chǎn)物的影響，培養(yǎng)液中pH的變化和菌體自身的生長代謝會影響培養(yǎng)液的pH，從而影響菌體的生長。發(fā)酵過程中，主要通過定時補料加入酸或堿。Jallouli等［12］利用溫帶發(fā)光桿菌突變菌體K122生產(chǎn)生物殺蟲劑，通過分批發(fā)酵和補料發(fā)酵的方法，未控制pH時，活菌密度為1.8×109CFU/mL；當(dāng)發(fā)酵pH被控制為7.0時，活菌密度為2.5×109CFU/mL。與不控制pH相比，活菌密度提高了38.8%。由此可知，pH是影響細胞生長和代謝產(chǎn)物形成的重要參數(shù)之一［13］。

3　補料分批培養(yǎng)策略

培養(yǎng)方式的選擇對菌體的生長有著重要的作用，高密度發(fā)酵生產(chǎn)的過程主要是補料分批發(fā)酵［14-15］。這種類型的方法包括指數(shù)流加和傳統(tǒng)的在線補料方法，比如pH、溶氧（DO）等［16-17］。補料分批發(fā)酵是在發(fā)酵過程中補入新鮮發(fā)酵液，以免造成營養(yǎng)成分不足而導(dǎo)致菌體生長不好甚至死亡，同時可以稀釋部分代謝有害物。補料分批發(fā)酵能維持較低的基質(zhì)濃度，避免碳源的阻遏效應(yīng)，并能減緩代謝有害物的不利影響。Sohoni等［18］在大腸桿菌中優(yōu)化高密度發(fā)酵工藝生產(chǎn)重組腈水解酶，利用連續(xù)補料的方法，細胞干質(zhì)量濃度達到19.5 g/L，腈水解酶產(chǎn)量為4.19×105U/L；而Liu等［19］在利用甘油補料時，腈水解酶的產(chǎn)量為1.93×104U/L。與普通的分批培養(yǎng)相比，這種補料分批的策略使生物量提高了8倍，腈水解酶的產(chǎn)量提高了2.4倍。在補料分批培養(yǎng)過程中，需結(jié)合菌體自身的特征，確定最佳的補料策略和補料方式，從而實現(xiàn)微生物的高密度和產(chǎn)物的高產(chǎn)量。

3.1溶氧補料策略

培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡時，細菌的有氧代謝活動下降，導(dǎo)致環(huán)境溶氧持續(xù)上升，加入營養(yǎng)物質(zhì)后溶氧又會下降。通過溶氧反饋控制限制性營養(yǎng)物質(zhì)的補加速率，使限制性營養(yǎng)物質(zhì)保持在一定的濃度，同時也避免了溶氧的抑制。當(dāng)碳源消耗，溶氧開始上升時，需要對生物反應(yīng)器設(shè)計一個預(yù)定的補料方案［20］。40%的溶氧水平最適合嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的高密度培養(yǎng)［21］，但是O2是一種難溶氣體，因此在實驗中常常會用搖床、發(fā)酵罐和通氣設(shè)備來增加溶氧［22］，但是也有Matsui等［23］研究在高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌過程中發(fā)現(xiàn)，溶氧并不是越多越好。好氧型菌體需要較高的DO才能生長，但厭氧型菌體在高DO時不適宜生長，應(yīng)根據(jù)菌體類型控制好DO的上下限。張鋒等［24］研究枯草芽胞桿菌谷氨酰胺合成酶工程菌利用溶氧反饋補料策略時，成功進行了工程菌的高密度培養(yǎng)，將溶氧的上限設(shè)為50%，高于DO時開始流加補料培養(yǎng)基，直到DO達到下限停止流加，最終細菌干質(zhì)量濃度達到48.1 g/L，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的55%，粗體物酶比活為10.35 U/mg。

3.2底物反饋流加策略

葡萄糖濃度的控制在補料式發(fā)酵中的重要性已經(jīng)受到了很多的關(guān)注［25-27］。在發(fā)酵過程中，微生物的性能和微生物產(chǎn)物的合成極大地影響了葡萄糖的濃度［28］。當(dāng)葡萄糖濃度充足時，會積累不必要的代謝產(chǎn)物，例如，乙醇和醋酸。為了避免產(chǎn)生不必要的代謝產(chǎn)物，必須控制葡萄糖的濃度［27-33］。葡萄糖是目前最常用的碳源，但糖的濃度過高，會對菌體的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。初始葡萄糖質(zhì)量濃度超過20 g/L，大腸桿菌生長就會受到抑制［34］。閔偉紅等［35］在堿性中和與補料分批高密度培養(yǎng)保加利亞乳桿菌的研究中發(fā)現(xiàn):當(dāng)每次加入2 g/L的8 mL葡萄糖時，最終菌密度達到9.0×1011CFU/mL，菌體干質(zhì)量濃度達14.266 g/L。

3.3代謝物的抑制

就傳統(tǒng)建筑項目而言，不僅價格昂貴，而且大部分建筑材料也會造成環(huán)境污染，給生活環(huán)境造成毒害，危害人類健康。從環(huán)保的角度來看，綠色節(jié)能材料能夠很好地解決這些問題。對人體無害，讓用戶更自信地生活，極大地增強了建筑的綠色環(huán)保性。從而為人們打造了更加舒適的居住環(huán)境，建設(shè)過程中的污染問題也得到了解決。

在高密度培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生一些有害的代謝產(chǎn)物，對菌體的生長有抑制作用。比如，甲醇積累會對酵母細胞的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，Brunel等［36］提出采用補料分批培養(yǎng)策略對平滑假絲酵母生產(chǎn)脂肪酶進行高細胞密度培養(yǎng)。發(fā)酵終點時，菌體質(zhì)量濃度達到了74.30 g/L左右，脂肪酶的活力為1.02×106U/L左右。因此，通過補料分批培養(yǎng)，可以有效避免甲醇積累對菌體生長的抑制。

3.4兩階段補料策略

微生物細胞快速生長時期與產(chǎn)物合成期處于一個動態(tài)平衡的過程，并不完全吻合，為了同時獲得高細胞密度和高產(chǎn)率，兩段式補料策略被引入。魯明波等［37］研究發(fā)現(xiàn):法夫酵母在發(fā)酵的延遲期和對數(shù)生長早期，通過流加控制葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L左右，在對數(shù)生長后期和穩(wěn)定期，控制糖質(zhì)量濃度為5 g/L。采用這種發(fā)酵方式，發(fā)酵終點細胞干質(zhì)量濃度為23.8 g/L，蝦青素產(chǎn)量最大達到29.05 g/L，分別比分批發(fā)酵提高了52.8%和109%，蝦青素的產(chǎn)量也比脈沖流加和恒pH流加高。該兩段式補料優(yōu)化控制方式基本達到產(chǎn)物合成最優(yōu)化和產(chǎn)物合成效率最高化。

3.5指數(shù)流加補料策略

指數(shù)流加是一種開環(huán)補料式的策略以去達到某種預(yù)定的值［20］。當(dāng)葡萄糖被消耗完之后，應(yīng)用指數(shù)流加策略將葡萄糖流加到培養(yǎng)基中（葡萄糖為最主要的限制性底物），葡萄糖流加量可以用下面的方程［38-39］計算。

式中:Ft是連續(xù)流加速率（L/h），X0和V0分別表示在補料分批培養(yǎng)的開始階段干細胞質(zhì)量濃度（g/L）和培養(yǎng)體積（L），Sf是流加中的葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L），μset是預(yù)定的生長速率，YX/S是增長的生物量和葡萄糖的量的比值（g/g）。在研究過程中，F(xiàn)t每個小時都會被改變?nèi)ツM指數(shù)流加過程。

Korz等［40］采用指數(shù)流加的補料方式，當(dāng)重組大腸桿菌分別以葡萄糖和甘油為碳源時，菌體質(zhì)量濃度分別達到了128 g/L和148 g/L。謝婷等［41］在指數(shù)流加補料發(fā)酵提高魯氏酵母β-1，3-葡聚糖酶產(chǎn)量中發(fā)現(xiàn)，15～23 h開始進行指數(shù)流加補料，細胞維持了對數(shù)生長至21 h（對應(yīng)最大生物量為12.86 g/L），而YEPD批培養(yǎng)33 h生物量達到10.78 g/L，相比之下，前者周期縮短了12 h，生物量提高了19.29%。

4　生物反應(yīng)器的選擇策略

生物反應(yīng)器是指包含了底物和酶或者細胞作為生物催化劑的一種設(shè)備或者系統(tǒng)，在這個環(huán)境中，生物催化劑可以執(zhí)行他們的功能。生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)、操作方式和操作條件對高密度培養(yǎng)的產(chǎn)物和產(chǎn)率有著重要的影響。

4.1攪拌式生物反應(yīng)器

攪拌式生物反應(yīng)器的混合程度較高，但其較大的剪切力并不利于絲狀菌和動植物細胞的培養(yǎng)，不過可以改變槳葉的尺寸和形狀，或者加入一些物質(zhì)來減小剪切力。其具有操作簡單、應(yīng)用范圍廣、容易放大培養(yǎng)等特點，所以，目前這種傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器應(yīng)用最為廣泛，也是高密度培養(yǎng)最常用的生物反應(yīng)器［42］。李佳偉等［43］采用3 L機械攪拌式發(fā)酵罐研究黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示，在固定控制條件下，固定轉(zhuǎn)速500 r/min時，發(fā)酵情況最好，產(chǎn)酸均達到12.9 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為86%，生物量為42.6 g/L。

4.2氣升式生物反應(yīng)器

氣升式生物反應(yīng)器與其他生物反應(yīng)器相比，設(shè)備的密封性好，有更強的抗雜菌污染能力。但是氣升式生物反應(yīng)器在發(fā)酵過程中容易起泡，這可能是由于培養(yǎng)基中的糖濃度較高引起的。氣升式生物反應(yīng)器適用于流體黏度相對不高、攪拌溫和［44］和氧傳質(zhì)要求較低［45-46］情況，但是其操作彈性小、軸向梯度高徑比大、高黏度時相間傳質(zhì)差等不利因素制約了其發(fā)展。鄭裕國等［47］在甘薯原料氣升式生物反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白中發(fā)現(xiàn)，采用10 L機械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中干物質(zhì)量為37.2 g/L，蛋白產(chǎn)量為17.7 g/L；10 L帶2塊篩板氣升式生物反應(yīng)器發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中干物質(zhì)量為39.6 g/L，蛋白產(chǎn)量為18.9 g/L。可以得出，氣升式生物反應(yīng)器在甘薯原料發(fā)酵生產(chǎn)單細胞蛋白中的發(fā)酵性能優(yōu)于機械攪拌發(fā)酵罐。

4.3膜生物反應(yīng)器

膜生物反應(yīng)器是生物處理法與膜技術(shù)相結(jié)合的一種先進技術(shù)。按照生物反應(yīng)器和膜組件之間的相對位置，可將膜生物反應(yīng)器分為以下3種:分置式膜生物反應(yīng)器，一體式膜生物反應(yīng)器，復(fù)合式膜生物反應(yīng)器。Inloes等［48-49］固定化酵母屬和大腸桿菌生產(chǎn)乙醇，但中空纖維膜生物反應(yīng)器不適用于有氧微生物，會導(dǎo)致供養(yǎng)不足。為了使需氧細胞生長，雙中空纖維膜生物反應(yīng)器被運用。在凝結(jié)芽胞桿菌TQ33高細胞密度培養(yǎng)過程中，戚薇等［50］采用中空纖維膜生物反應(yīng)器過濾乳酸，最終菌體密度達到1.6×1010CFU/mL，芽胞密度達到1.2×1010CFU/mL，分別是分批培養(yǎng)的21倍和37倍。Tashiro等［51］在利用高細胞密度培養(yǎng)的方法生產(chǎn)丙酮丁醇乙醇（ABE）的過程中，使用中空纖維膜生物反應(yīng)器進行培養(yǎng)，經(jīng)過48 h培養(yǎng)后，最終菌體質(zhì)量濃度高于100 g/L，ABE的產(chǎn)率為7.55 g/（L·h），分別是傳統(tǒng)連續(xù)培養(yǎng)的20倍和4倍。

5　多級連續(xù)高密度培養(yǎng)（MSC HCDC）體系

普通的補料分批培養(yǎng)是指在一個生物反應(yīng)器內(nèi)進行多次補料，而MSC- HCDC是指多個生物反應(yīng)器中單獨補料。MSC-HCDC體系包括多個串聯(lián)的中空纖維細胞循環(huán)或者用于細胞固定的高細胞密度培養(yǎng)的連續(xù)攪拌反應(yīng)器。Chang等［52］在一個8級MSC-HCDC系統(tǒng)中生產(chǎn)青霉素，生產(chǎn)率為149%（0.085 g/（L·h）），細胞質(zhì)量濃度為40 g/L；在一個7級MSC-HCDC系統(tǒng)中生產(chǎn)青霉素，生產(chǎn)率為289%（0.165 g/（L·h）），細胞質(zhì)量濃度為60 g/L。一般來說，一個帶有2個或者3個生物反應(yīng)器的MSC -HCDC系統(tǒng)，可以代替補料式生物反應(yīng)器去獲得較高產(chǎn)率的細胞外和細胞內(nèi)的產(chǎn)物?，F(xiàn)在這種體系已經(jīng)被廣泛地運用，它的高產(chǎn)率和高效價成為其發(fā)展優(yōu)勢。

6　展望

高密度培養(yǎng)是實現(xiàn)微生物產(chǎn)品高生產(chǎn)率和高效率的關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)已成為生化工程的重要研究領(lǐng)域。高密度培養(yǎng)策略的優(yōu)化是完善高密度培養(yǎng)技術(shù)的首要問題，同時，需要加強研究高密度培養(yǎng)的發(fā)酵動力學(xué)、多級連續(xù)高細胞密度培養(yǎng)技術(shù)并解決培養(yǎng)過程中的膜污染等問題，盡早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。由于微生物高密度培養(yǎng)的巨大優(yōu)勢，高密度培養(yǎng)技術(shù)在食品、藥品、微生物采油領(lǐng)域的應(yīng)用將越來越廣泛。

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（責(zé)任編輯 管珺）

Strategy of high cell-density culture of microorganisms

ZUO Xiaoxiao1，LU Lixia1，2，LI Yi1，2，XIONG Xiaohui1，2
（1.College of Food Science and Light Industry，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety，Nanjing 211800，China）

High cell-density culture could shorten total production period，increase productivity and decrease cost.It has been currently a hot issue in research of fermentation engineering.In this review，we summarized the strategies of nutrients，feeding，environmental factors，bioreactor，metabolic regulation to analyze how to improve high cell-density culture.We also demonstrate that high cell-density fermentation can become more effective by considering multiple factors in process design and implementation，such as microbial strains，their metabolic characteristics and nutritional requirements.

High cell-density culture；bioreactor；metabolic regulation

TQ920.1

A

1672-3678（2016）03-0081-06

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.015

2016-03-09

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2013AA064402）

左肖肖（1991—），女，江蘇邳州人，研究方向:發(fā)酵工程；陸利霞（聯(lián)系人），副教授，E-mail:lixialu@njtech.edu.cn