樊秀雙，郭軍堂，陳安琪

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濰坊　261053)

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真核表達(dá)載體GV394-Nurr1的構(gòu)建及鑒定

樊秀雙，郭軍堂，陳安琪*

(濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濰坊261053)

目的構(gòu)建含人源性Nurr1基因真核表達(dá)載體GV394-Nurr1，檢測(cè)其瞬時(shí)表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)(ROS)水平的影響。方法 PCR擴(kuò)增人Nurr1基因,克隆至T載體，測(cè)序正確后與真核載體GV394一起,經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切,T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建GV394-Nurr1；采用脂質(zhì)體將GV394-Nurr1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)Nurr1基因mRNA水平，通過(guò)DCFH-DA染色檢測(cè)Nurr1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。 結(jié)果 PCR及測(cè)序證實(shí)人Nurr1基因正確克隆至真核表達(dá)載體GV394; RT-PCR顯示Nurr1基因mRNA水平在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中明顯增高;DCFH-DA染色顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Nurr1的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)的ROS水平峰值較對(duì)照組明顯左移。結(jié)論成功構(gòu)建人源性Nurr1真核載體，可在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)并減少細(xì)胞內(nèi)ROS水平，為進(jìn)一步在體外研究Nurr1的功能及其與多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

Nurr1；真核表達(dá)載體；帕金森氏病；細(xì)胞活性氧；

帕金森氏病(Parkinson disease,PD)是與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作徐緩、姿態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)功能障礙和自主神經(jīng)功能障礙。多巴胺代謝異常是PD發(fā)病的核心機(jī)制，幾乎每一種有關(guān)調(diào)控多巴胺代謝基因的多態(tài)及突變都能影響多巴胺代謝酶的含量，共同最終導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元的應(yīng)激損傷，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目上相應(yīng)的減少[1]。孤核受體Nurr1廣泛表達(dá)于胚胎和成體中腦黑質(zhì)腹側(cè)被蓋區(qū)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育和存活過(guò)程中起到了重要的作用[2]?；蚯贸齆urr1(-)的小鼠細(xì)胞免疫熒光顯示DA神經(jīng)元前體細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育不全[3]。本研究通過(guò)構(gòu)建Nurr1真核表達(dá)載體，研究其過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平的影響，為研究Nurr1參與PD神經(jīng)元變性的保護(hù)作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為臨床指導(dǎo)Nurr1有可能作為帕金森病基因治療提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要試劑

大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)保存；質(zhì)粒GV394、限制性內(nèi)切酶，人腦 cDNA文庫(kù)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司；Liptap脂質(zhì)體、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自碧云天公司；PCR引物、平端DNA加A試劑盒、 T載體均自上海生工； Trizol試劑、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、 PrimeSTAR HS DNA polymerase試劑盒均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；DCFH-DA染色試劑盒購(gòu)自于Sigma公司；其余化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1真核表達(dá)載體GV394-Nurr1的構(gòu)建與鑒定

依據(jù)NCBI NM_006186.3 NR4A2基因信息設(shè)計(jì)引物，5’-TTGGTACCGAGCTCGGATCCCGCCACC ATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3’，下游引物5’-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGTTAGAAAGGTAAAG TGTCCA GG-3’。以人腦 cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR：98℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸 90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 8 min。膠回收后的PCR產(chǎn)物利用平端DNA加A試劑盒進(jìn)行加“A”后與pUCm- T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌。小量提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR及BamHI和XhoI雙酶切鑒定并送上海生工進(jìn)行測(cè)序，正確克隆命名為體pCUm-T- Nurr1。BamHI和XhoI雙酶切載體GV394質(zhì)粒及pCUm-T- Nurr1，將純化回收的1541bp大小的目的片段與酶切后線性化的GV394質(zhì)粒用T 4DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR反應(yīng)鑒定挑選正確的克隆，命名為GV394-Nurr1。

1.2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y密度達(dá)到80%左右時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，使每孔細(xì)胞密度達(dá)到2-6×105，均勻接種到6孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確保第二天細(xì)胞密度能達(dá)到70-80%。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將GV394-Nurr1轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空載GV394為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24 h后，用Trizol RNA提取試劑盒抽提總RNA，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Nurr1 mRNA的表達(dá)。Nurr1的PCR條件同1.2.1。內(nèi)參β-actin引物：上游引物：5‘GACCCAGATCATGTTTGAGA 3 ’下游引物：5‘GCTTGCTGATCCACATCTGC3 ’ , PCR循環(huán): 98℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 8 min。

1.2.3DCFH-DA染色法檢測(cè)Nurr1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響

胰酶消化實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液，1000 rpm 離心5 min，離心2次，500 μL的PBS輕輕重懸沉淀，加入工作液10 μmol/L的DCFH-DA熒光染料1 μL，室溫避光孵育15 min，流氏細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm來(lái)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，重復(fù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1全長(zhǎng)人Nurr1的PCR擴(kuò)增

如圖1A所示，PCR擴(kuò)增出與預(yù)期產(chǎn)物大小一致的1541 bp人Nurr1 DNA片段。

2.2pCUm-T- Nurr1的鑒定

如圖1B所示，小量提取質(zhì)粒后，PCR擴(kuò)增后得到一條1541 bp左右的條帶，與預(yù)期大小一致。如圖1C所示，質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切得到一條1500 bp左右的目的條帶和2700 bp左右大pCUm-T載體條帶，與預(yù)期大小一致。 對(duì)PCR和酶切鑒定成功的pCUm-T- Nurr1克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果與Genebank堿基序列完全一致。

2.3GV394-Nurr1的鑒定

重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，如圖1D所示，在1.5 kb左右呈現(xiàn)與Nurr1分子量大小相符DNA條帶，結(jié)果證實(shí)人Nurr1基因成功插入真核GV394載體中。

注：(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR產(chǎn)物；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR產(chǎn)物；(3)pCUm - T- Nurr1經(jīng)BamH I和X hoI酶切產(chǎn)物；(4)GV394-Nurr1 PCR產(chǎn)物。圖1　瓊脂糖凝膠電泳鑒定Note.(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR products；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR products；(3)pCUm - T- Nurr1 by I BamH and hoI X enzyme digestion products；(4)GV394-Nurr1 PCR products.Fig.1　Agarose gel electrophoresis

2.4RT-PCR檢測(cè)Nurr1 mRNA表達(dá)

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)絇CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，如圖2A所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均見特異性條帶，大小為1541 bp，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組條帶亮些，圖像經(jīng)IPP圖像系統(tǒng)分析，如圖2B在內(nèi)參灰度值大致相同的情況下，實(shí)驗(yàn)組Nurr1/內(nèi)參的灰度值之比(0.754±0.02)較對(duì)照組Nurr1/內(nèi)參的灰度值之比(0.347±0.03)明顯增高，兩組差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.55,P< 0.01),提示表達(dá)載體GV394-Nurr1在SHSY5Y細(xì)胞中能夠瞬時(shí)表達(dá)。

2.5DCFH-DA染色法檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)Nurr1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響

本實(shí)驗(yàn)采用DCFH-DA染色，通過(guò)流氏細(xì)胞儀檢測(cè)ROS峰值的變化精確反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化，ROS峰值左移提示抑制細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，如圖3所示，瞬時(shí)表達(dá)Nurr1的細(xì)胞內(nèi)的ROS峰值較對(duì)照組明顯左移，表明過(guò)表達(dá)Nurr1抑制了SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。

3　討論

PD是常見的一種中老年人常見的中樞神經(jīng)錐體外系統(tǒng)疾病，其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性喪失和路易氏小體(Lewy Body)的形成[4]。迄今為止，對(duì)選擇性多巴胺神經(jīng)元缺失的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究認(rèn)為，眾多因素都參與了PD的發(fā)病機(jī)制，但其最終的結(jié)局是中樞神經(jīng)內(nèi)多巴胺含量減少，使多巴胺能神經(jīng)元應(yīng)激性損傷敏感性增加。因此，對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)發(fā)育分化基因調(diào)節(jié)機(jī)制的研究有助于了解帕金森氏疾病的發(fā)病機(jī)制。

注：(A)RT-PCR圖；(B)灰度掃描分析圖(1)實(shí)驗(yàn)組Nurr1；(2)對(duì)照組Nurr1；(3)實(shí)驗(yàn)組β-actin；(4)對(duì)照組β-actin；(5)DNA Marker。與對(duì)照組比較，*P < 0.05。圖2　Nurr1 mRNA 表達(dá)Note.(A)RT-PCR image；(B)The result of gray scale analysis；(1)Experimental group；(2)Control group；(3)Experimental group(β-actin)；(4)Control group(β-actin)；(5)DNA Marker. *P < 0.05，Compared with control group.Fig.2　The expression of Nurr1 mRNA

圖3　流氏細(xì)胞儀檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)Nurr1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.3　Flow cytometry detection the effect of transient expression of Nurr1 on the intracellular

Nurr1又稱孤核受體因子，定位于染色體2q22 -q23[5]，由598個(gè)氨基酸組成，分子量大約為66KD,主要分布于中腦黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)，作為轉(zhuǎn)錄蛋白因子對(duì)多巴胺的發(fā)育和存活有著重要的作用。Nurr1作為配體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子包含DNA結(jié)合區(qū)域(DBD)，配體結(jié)合區(qū)域(LBD)，N端可變區(qū)，在外界環(huán)境的刺激激活MAPK通路，調(diào)控下游基因的表達(dá)[6]。Kaoru等[7]發(fā)現(xiàn)在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞中Nurr1能夠募集Co REST([co]repressor for element-1-silencing transcription factor)復(fù)合物形成反式通路對(duì)神經(jīng)毒素物質(zhì)致炎效應(yīng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的防御反應(yīng)，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)性研究證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Nurr1可以保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受LPS和A30P α-Synuclein產(chǎn)生的毒害反應(yīng)。實(shí)時(shí)定量PCR顯示在過(guò)表達(dá)α-Synuclein大鼠中Nurr1基因表達(dá)量減少，給予體外帕金森病動(dòng)物模型Nurr1及類視黃醇X受體配體的刺激后結(jié)果顯示α-Synuclein表達(dá)下降[8]。因此，可以推測(cè)Nurr1蛋白表達(dá)抑制了α-Synuclein對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用。體外研究證明，Nurr1在轉(zhuǎn)錄因子LmxIb(LIM homeobox transcription factor 1 beta)和EN(Engrailed)蛋白的共同參與下，通過(guò)Lmxlb驅(qū)動(dòng)Pitx3(paired-like homeodomain transcription factor 3)介導(dǎo)調(diào)控多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育、存活[9, 10]。通過(guò)基因敲除技術(shù)，缺失Nurr1基因表達(dá)的小鼠實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，其體內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)含量下降，活性水平降低，多巴胺含量減少，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少，小鼠表現(xiàn)出對(duì)MPTP毒素的敏感性增加，表明降低Nurr1表達(dá)及其活性，失去了對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用[11, 12]。Nurr1表達(dá)促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育、存活、成熟方面起到了重要的作用，但是Nurr1如何參與調(diào)控尚存在爭(zhēng)議。

本研究以人腦 cDNA文庫(kù)為模板，成功擴(kuò)增出人全長(zhǎng)Nurr1基因，并構(gòu)建了真核細(xì)胞表達(dá)載體GV394-Nurr1，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該基因能夠在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且能夠降低了細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，這為進(jìn)一步研究Nurr1對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的分化、成熟的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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The construction and identification of eukaryotic expression vector GV394-Nurr1

FAN Xiu-shuang,GUO Jun-tang,CHEN An-qi*

(Clinical College，Weifang Medical University，Weifang 261053,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector GV394-Nurr1 containing humanNurr1 gene and to study the effects of transient transfection ofNurr1 on intracellular reactive oxygen species level. Methods The full-length of human Nurr1 gene amplified by PCR was subcloned into T vector and sequenced. GV394-Nurr1 vector was constructed by BamHI and XhoI double digestion and then T4 DNA ligase conjunction. GV394-Nurr1 was transfected into SH-SY5Y cells by liposome transfection technique; The mRNA ofNurr1 was detected by RT-PCR; The effect ofNurr1 expression on intracellular reactive oxygen species (ROS)was detected by (DCFH-DA) staining.ResultsPCR and sequencing confirmed that theNurr1 gene was correctly cloned into eukaryotic expression vector GV394. The RT-PCR results showed that theNurr1 mRNA expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cells transiently transfectedNurr1 was higher than that in the control group. DCFH-DA staining showed that the level of reactive oxygen peak in neuroblastoma cells transiently transfectedNurr1 obviously shifted to the left compared to the control group. ConclusionsThe humanNurr1 gene eukaryotic expression vector was successfully established and its high expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cell line significantly decreased the ROS level. This provide the basis for further study on the function ofNurr1 in vitro and its relationship with the protective effect of dopaminergic neurons.

Nurr1; Eukaryotic expression vector; Parkinson disease; Reactive oxygen species

山東省自然科學(xué)基金(ZR2011HM014)。

樊秀雙(1990-)，女，碩士研究生，研究方向: 帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究。 Email: Fanxiushuang0314@163.com。

陳安琪 (1981-)，女, 醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：帕金森發(fā)病機(jī)制。Email:chenanqi_1981@163.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0031-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.005

2016-03-31