張　梅，王躍新*，侯曉華，洪　軍，殷勝春，李　巖，劉慶陽

(1.唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山　063000；2. 煤炭總醫(yī)院，北京　100028)

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bcl-2 基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷

張梅1，王躍新1*，侯曉華1，洪軍1，殷勝春1，李巖1，劉慶陽2

(1.唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山063000；2. 煤炭總醫(yī)院，北京100028)

目的探討bcl-2 基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞， 經(jīng)Ad-EGFP為載體介導(dǎo)端B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，分為3組：對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、bcl-2轉(zhuǎn)染組。Western-blot檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后bcl-2蛋白的表達(dá)。成年雌性SD大鼠85只，造模成功72只,隨機(jī)分為對(duì)照組，NSCs組，bcl-2-NSCs組, 24只/組，按照改良的Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。通過BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。造模后7 d通過RT-PCR及Western-blot檢測(cè)檢測(cè)脊髓損傷區(qū)周圍HSP27、c-fos基因的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。造模后4周取材行病理切片HE染色及熒光顯微鏡觀測(cè)EGFP標(biāo)記的NSC存活及分布情況，通過SEP和MEP觀察大鼠神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。結(jié)果bcl-2基因轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)干細(xì)胞后，bcl-2轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比bcl-2基因和蛋白水平均有表達(dá)(P< 0.05)；大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)bcl-2-NSCs組優(yōu)于NSCs組，NSCs組優(yōu)于對(duì)照組。造模后72 h，bcl-2-NSCs組細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯低于對(duì)照組和NSCs組(P< 0.05)。造模后7 d，與對(duì)照組和NSCs組相比，bcl-2-NSCs組HSP27基因和蛋白的表達(dá)均較顯著升高(P< 0.05)，bcl-2-NSCs組c-fos基因和蛋白的表達(dá)較顯著降低(P< 0.05)。造模后4周，HE染色對(duì)照組可見脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無神經(jīng)軸索通過。NSCs組損傷區(qū)可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，脊髓空洞較小，bcl-2-NSCs組可見較多神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見脊髓空洞。EGFP標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)：bcl-2-NSCs組最多，NSCs組次之，對(duì)照組未見，且各組之間差異有顯著性(P< 0.05)。造模后4周，SEP和MEP的潛伏期：bcl-2-NSCs組NSCs組>對(duì)照組，且各組之間差異有顯著性意義(P< 0.05)。結(jié)論通過Ad-EGFP為載體介導(dǎo)端B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(bcl-2)基因轉(zhuǎn)染使神經(jīng)干細(xì)胞能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 bcl-2 基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植可促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，升高脊髓損傷區(qū)HSP27表達(dá)，降低脊髓損傷區(qū)bcl-2基因的表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能和電生理功能。

脊髓損傷；bcl-2 基因；修飾；神經(jīng)干細(xì)胞；移植；修復(fù)；大鼠；神經(jīng)功能

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷，可導(dǎo)致創(chuàng)傷部位以下區(qū)域感覺和運(yùn)動(dòng)功能的不可逆損傷，且缺乏有效的治療方法。在創(chuàng)傷區(qū)內(nèi)抑制細(xì)胞凋亡對(duì)脊髓保護(hù)是非常重要的[1]。然而，由于SCI的病理生理機(jī)制的復(fù)雜性及多變性，還沒有令人滿意的藥物或外科手術(shù)來治愈SCI[2]，因此，對(duì)SCI潛在治療方法的發(fā)掘仍迫在眉睫。

神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是指具有分化為神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞能力，且能夠自我更新并形成神經(jīng)組織的細(xì)胞[3]。NSC具有的定向遷移、組織融合及免疫豁免性，使其在損傷移植后可以很好的存活。且研究已證實(shí)NSC移植安全有效，對(duì)小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育無明顯影響。

B淋巴細(xì)胞瘤-2在神經(jīng)系統(tǒng)及其他多種組織均有表達(dá)。SCI后，Bcl-2蛋白在幸存神經(jīng)元中表達(dá)量明顯增加，提示它是一種神經(jīng)系統(tǒng)重要的保護(hù)性因子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)， Bcl-2的過表達(dá)能夠使中樞神經(jīng)繼發(fā)性損傷減輕，改善預(yù)后，但是有關(guān)機(jī)制尚未闡明。本文將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染NSC細(xì)胞，檢測(cè)NSC細(xì)胞的生物學(xué)特性，并進(jìn)一步探討B(tài)cl-2-NSC對(duì)大鼠SCI功能恢復(fù)的影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠85只，1月齡，體重(230～270)g。購(gòu)自唐山恒安生物工程有限公司【SCXK(冀)2010-0-055】，唐山工人醫(yī)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK(冀)2011-0012】。

1.2主要試劑與儀器

胰蛋白酶(美國(guó)Santa Cruz 公司)；PBS 緩沖液粉劑(福州邁新)；Western-blot蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó) Santa Cruz 公司)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime 公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma 公司)；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce)；Bcl-2單克隆抗體(北京中山試劑公司)；TUNEL染色試劑盒(Promega)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；HSP-27(美國(guó)Abcam公司)；KEYPOINT 4誘發(fā)電位儀(北京市康泰醫(yī)療器械有限公司)；掃描分析軟件系統(tǒng)(Labworks Analysis Software，美國(guó))。1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定標(biāo)記、NSC及bcl-2-NSC懸液的制備

取孕14 d的SD大鼠處死，75%的酒精浸泡消毒。切取胎鼠大腦，浸泡在DMEM/F12液中，去除腦膜和血管。將去除腦膜和血管的胎腦浸泡于DMEM/F12液中，用吸管反復(fù)吹打成懸液，過100目孔篩網(wǎng)，過濾的懸液接種于培養(yǎng)瓶中，加EGF, bFGF，N2添加劑，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后換液。培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞3 d后接種到涂布多聚賴氨酸的蓋玻片上，以一抗Brdu 1:400的比例，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，并用DAB 顯色。對(duì)形成的神經(jīng)球行nestin免疫組織化學(xué)染色，進(jìn)行鑒定。 將移植前2 d呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NSC進(jìn)行離心，添加培養(yǎng)液，反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將種植密度調(diào)整為1×106/mL。在培養(yǎng)瓶中加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為200PFU/細(xì)胞漿含bcl-2-Ad-EGFP顆粒的儲(chǔ)存液，于培養(yǎng)箱中溫育48 h后離心，并棄去上清液，再次吹打至單細(xì)胞懸液并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將種植密度調(diào)整為2×107個(gè)/μL。同時(shí)制備單純NSC懸液(濃度為2×107個(gè)/μL)。1.3.2Western-blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h，按照3組細(xì)胞,提取總蛋白，5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗體Bax或BCL-2(1∶800)4℃ 過夜；抗鼠β-actin(1∶1 000)4℃過夜。TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗體1∶700，37℃搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次運(yùn)用TBS洗膜10 min后DAB顯色，BCL-2與β-actin的灰度積分的比值進(jìn)行分析，作為BCL-2 蛋白表達(dá)的量。

1.3.3大鼠SCI模型的制備及干預(yù)

將SD大鼠進(jìn)行麻醉、固定并剃毛，暴露大鼠棘突和椎板，將T8-9的棘突及部分椎板切除，并將黃韌帶切除，顯露出硬腦膜。按照改良Allen法操作方法依次設(shè)計(jì)打擊錘重量為10 g，打擊高度為2.5 cm進(jìn)行脊髓打擊，鼠尾及雙后肢可見痙攣性伸直片刻后又松弛表示造模成功,參考Zlokovic等[4]的方法將造模成功后3 d動(dòng)物再次麻醉后進(jìn)行細(xì)胞移植，隨機(jī)分為3組，每組24只，單獨(dú)放于3個(gè)籠子里。保持動(dòng)物良好的衛(wèi)生條件，允許其自由采食，并給與供水。其中，對(duì)照組：SCI后注入5 μL生理鹽水溶液；NSCs組：注入等量NSC懸液；bcl-2-NSCs組：注入等量bcl-2-NSC懸液(細(xì)胞數(shù)均為2×107個(gè)/μL)。

1.3.4運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

3組大鼠均于SCI后的不同時(shí)期采用BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能。BBB評(píng)分[5]：共22級(jí)，0級(jí)：后肢完全癱瘓，21級(jí)：功能正常，主要觀察指標(biāo)包括關(guān)節(jié)活動(dòng)次數(shù)，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、范圍，前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的協(xié)調(diào)程度。斜板試驗(yàn)：大鼠放置在光滑的木板上，體軸垂直于板的垂直軸，每個(gè)試驗(yàn)斜板的角度增加5度，當(dāng)最大角度時(shí)大鼠可停留5秒，則認(rèn)為有功能價(jià)值。

1.3.5RT-PCR及Western-blot 檢測(cè)HSP-27、c-fos基因的表達(dá)

取各組大鼠損傷區(qū)的脊髓組織50 mg，Trizol 法提取總RNA，用RT-PCR兩步法試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA行PCR擴(kuò)增。HSP27的引物序列：上游5’-GGCGCTCAACCGGCAACTCA-3’,下游5’-CTCAGGGACAGGGAAGAG-3’,GAPDH：上游5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’,下游：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’,c-fos：上游5’- GAC AGC CTT TCC TAC TAC CAT TTC C-3’,下游5’-CCA TCT TAT TCC TTT CCC TTC-3’反應(yīng)條件：94℃ 5 min之后，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，23個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳。RT-PCR提取后的剩余物經(jīng)1500 r/min 離心30 min后，取上清為粗體蛋白， Bradford法測(cè)定總的蛋白濃度。5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h， 洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗體HSP-27或c-fos(1∶800)4℃ 過夜；抗鼠GAPDH(1∶1000)4℃過夜。TBST洗膜5 min×4 次，山羊抗兔抗體1∶700，37℃搖床孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×4 次。再次運(yùn)用TBS洗膜10 min后DAB顯色，HSP-27、c-fos與GAPDH的灰度積分的比值進(jìn)行分析，為HSP-27、c-fos 蛋白表達(dá)的量。1.3.6TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取脊髓組織進(jìn)行石蠟切片處理。TUNEL法檢測(cè)按德國(guó)Roche公司試劑盒購(gòu)操作。待水化、37℃條件下蛋白酶K消化10 min，進(jìn)行標(biāo)記液標(biāo)記后， 37℃下，經(jīng)生物素化的地高辛反應(yīng)30 min，加SABC，DAB顯色。封片后對(duì)胞核含棕黃色顆粒的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.7HE染色及熒光顯微鏡觀察EGFP標(biāo)記的NSC存活及分布

3組各隨機(jī)取5只大鼠，取脊髓組織，固定用4%多聚甲醛，沖洗用生理鹽水。從病變部位取長(zhǎng)約1 cm的完整脊髓，經(jīng)分級(jí)系列酒精脫水，縱向切片，厚約20 μm，進(jìn)行HE染色。隨機(jī)取10個(gè)視野，用高倍熒光顯微鏡(×20)觀察EGFP標(biāo)記的NSC的存活及分布情況。

1.3.8檢測(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位

每組隨機(jī)取5只大鼠，用KEYPOINT 4誘發(fā)電位儀檢測(cè)后肢體感及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位。將大鼠進(jìn)行麻醉、固定，并準(zhǔn)確安放參考及記錄電極。直流波電脈沖刺激參數(shù)設(shè)計(jì)：3 Hz的頻率，0.2 ms的波寬，5～15 mA的電流強(qiáng)度，50～60倍的疊加次數(shù)，后肢有輕微抽搐為參數(shù)設(shè)計(jì)良好。觀察并記錄數(shù)值變化。同樣的方法檢測(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位并記錄。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1NSCs體外培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記

腦組織單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶后1 h，大部分細(xì)胞沉積在瓶底，呈圓形、無突起，同時(shí)可以觀察到小的細(xì)胞團(tuán)，其中NSCs細(xì)胞數(shù)量較少。1 d后NSCs增多、較小、形狀不規(guī)則，小部分細(xì)胞團(tuán)貼壁；5 d后NSCs增多，為較大、形狀規(guī)則的球形。免疫組化染色顯示，NSCs球呈Nestin強(qiáng)陽性表達(dá)。

2.2Western-blot

基因在轉(zhuǎn)染3 d及14 d后，bcl-2轉(zhuǎn)染組的神經(jīng)干細(xì)胞檢測(cè)到 bcl-2 蛋白表達(dá)明顯，而對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組 bcl-2蛋白無表達(dá)，說明了bcl-2基因已穩(wěn)定整合入bcl-2轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞中，且可以行目的蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，如圖2A-B所示。

2.3運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定結(jié)果

造模前所有大鼠的BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)評(píng)分差異均無顯著性意義(P< 0.05)。移植后4周，NSCs組，bcl-2-NSCs組兩項(xiàng)評(píng)分在損造模后2～4周較對(duì)照組都明顯增加，差異有顯著性意義(P< 0.05)。bcl-2-NSCs組兩項(xiàng)評(píng)分在損造模后2～4周較NSCs組明顯增加，差異有顯著性意義(P< 0.05)，見表1。

表1　各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定結(jié)果(n=5)

注：與對(duì)照組相比，aP< 0.05；與NSCs組相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group,aP<0.05;Compared with NSCs groupbP<0.05.

注：(1A)倒置微鏡下觀察培養(yǎng)的原代神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)(×40)；(1B)神經(jīng)干細(xì)胞Nestin免疫熒光化學(xué)染色陽性(×40)；(1C)EGFP標(biāo)記的NSCs(×100)。圖1　神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記Note.(1A)primary neural stem cell morphology was observed under inverted microscope cultured(×40)；(1B)neural stem cells Nestin immunofluorescence staining(×40)；(1C)EGFP-labeled NSCs(×100).Fig.1　Culture, identification and labeling of neural stem cells

注：(A)轉(zhuǎn)染3 d；(B)轉(zhuǎn)染14 d。圖2　bcl-2蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)Note.(A)Transfection 3 days；(B)Transfection 14 days.Fig.2　Bcl-2 protein was stably expressed in neural stem cells

注：(3A)對(duì)照組；(3B)NSCs組；(3C)bcl-2-NSCs組。圖3　HE染色觀察各組神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)(×40)Note.(3A)The control group；(3B)NSCs group；(3C)bcl-2-NSCs group.Fig.3　HE staining in each group of neural cell-like morphology

注：(4A)對(duì)照組；(4B)NSCs組；(4C)bcl-2-NSCs組。圖4　熒光顯微鏡觀察EGFP標(biāo)記的綠色熒光細(xì)胞(×20)Note.(4A)The control group；(4B)NSCs group；(4C)bcl-2-NSCs group.Fig.4　Fluorescence microscopy of GFP-tagged green fluorescent cells

2.4HE染色和熒光顯微鏡觀察

傷后4周，HE染色對(duì)照組可見損傷處脊髓組織斷裂，為瘢痕連接，有明顯空洞形成 (圖3A)。NSCs組在移植部位組織空洞較對(duì)照組小，較bcl-2-NSCs組大(圖3B)。bcl-2-NSCs組空洞消失(圖3C)。NSCs組及bcl-2-NSCs組切片中均可見散在的EGFP標(biāo)記的陽性的綠色熒光(圖4A-C)：對(duì)照組為(0±0.00)個(gè)/高倍視野，NSCs組為(12.15±3.24)個(gè)/高倍視野，bcl-2-NSCs組為(27.34±4.41)個(gè)/高倍視野，各組之間差異顯著(P<0.01)。

2.5HSP-27、c-fos基因和蛋白的表達(dá)

造模后7天，與對(duì)照組和NSCs組相比，bcl-2-NSCs組HSP27基因的表達(dá)顯著升高，P< 0.05，c-fos基因的表達(dá)顯著降低P< 0.05；與對(duì)照組比較，NSCs組GSP27蛋白的表達(dá)顯著升高，P< 0.05，c-fos蛋白的表達(dá)顯著降低P< 0.05，見圖5。

2.6TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

凋亡神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)可見特異性棕黃色顆粒，TUNEL法測(cè)定，NSCs組中，免疫組化呈棕黃色顆粒的凋亡細(xì)胞數(shù)(20.41±4.38)明顯少于對(duì)照組(30.12±3.44)(P< 0.05)，bcl-2-NSCs組凋亡細(xì)胞最少(9.57±2.31)。見圖6。

2.7體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位

移植后4周，對(duì)照組體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位少量恢復(fù)，bcl-2-NSCs組感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位明顯恢復(fù)，波幅增高。各組大鼠體感誘發(fā)電位潛伏期和波幅，見表2。NSCs組與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P< 0.05)。bcl-2-NSCs組與對(duì)照組比較差異有非常顯著性意義(P< 0.01)。NSCs組與bcl-2-NSCs組比較差異有顯著性意義(P< 0.05)，表明bcl-2-NSCs組電信號(hào)從后肢到頭皮傳導(dǎo)時(shí)間比其他組都短，傳導(dǎo)通路已經(jīng)暢通，恢復(fù)較好。

圖5　脊髓損傷區(qū)HSP-27、c-fos基因與蛋白的表達(dá)Fig.5　Expression of HSP-27、c-fos gene and protein in spinal cord injury

注：(6A)對(duì)照組；(6B)NSCs組；(6C)bcl-2-NSCs組。圖6　TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡(×20)Note.(6A)The control group；(6B)NSCs group；(6C)bcl-2-NSCs group.Fig.6　TUNEL staining of each group

組別(group)體感誘發(fā)電位(somatosensoryevokedpotential,SEP)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(motorevokedpotentials,MEP)潛伏期(ms)波幅(μV)潛伏期(ms)波幅(μV)對(duì)照組(comparisongroup)32.241±2.4571.236±0.11616.227±0.3471.635±0.121NSCs組(NSCsgroup)26.821±2.530a1.727±0.117a12.436±0.244a2.447±0.319abcl-2-NSCs組(bcl-2-NSCsgroup)17.237±1.418b2.231±0.125b8.741±0.329b3.738±0.445b

注：與對(duì)照組相比，aP< 0.05；與NSCs組相比bP< 0.05。

Note.Compared with the control group，aP<0.05;Compared with NSCs group，bP<0.05.

3　討論

SCI的病理損傷分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI[5]。發(fā)生前者時(shí)，損傷的脊髓組織會(huì)經(jīng)歷神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷等破壞性及軸突再生等修復(fù)性過程，屬于不可逆性損傷。后者則是由前者引發(fā)的一系列神經(jīng)病理變化，給予積極的治療手段可減慢其發(fā)生、發(fā)展，屬于可控性損傷，所以目前將繼發(fā)性SCI作為研究的焦點(diǎn)[6]。近來，Bcl-2減輕繼發(fā)性SCI的作用越來越引起關(guān)注，除了抗凋亡功能外，一些研究提示，過表達(dá)的Bcl-2能夠阻止由中毒、缺氧、缺乏生長(zhǎng)因子等誘發(fā)的神經(jīng)元死亡[7]，提示Bcl-2對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)作用是多方面的[8]。

Bcl-2基因家族包括促進(jìn)(Bax)和抑制(Bcl-2)細(xì)胞凋亡的兩大類成員，是SCI后細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因。研究認(rèn)為，Bcl-2與Bax以二聚體的形式在體內(nèi)發(fā)揮作用，二者的比例是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵[9]。燕景峰等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2組表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上較SCI、NSC組明顯增多，凋亡率降低。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用多項(xiàng)技術(shù)，研究了Bcl-2-NSC治療小鼠SCI后機(jī)體的恢復(fù)情況。通過Ad-EGFP為載體介導(dǎo)Bcl-2基因轉(zhuǎn)染使神經(jīng)干細(xì)胞能夠明顯抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及修復(fù)，與前人的研究結(jié)果一致。

HSP是其中重要的一員，主要參與穩(wěn)定細(xì)胞骨架。路艷等[11]發(fā)現(xiàn)，HSP(heat shock proteins，熱休克蛋白，簡(jiǎn)稱為HSP)可與APaf-1結(jié)合，阻止形成APaf-1/Cyt-c/casPase-9凋亡復(fù)合體，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，Bcl-2高表達(dá)小鼠的脊髓標(biāo)本上HSP的表達(dá)明顯升高，對(duì)提高脊髓的應(yīng)激性、耐受缺血缺氧等損傷明顯是有利的。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了探索，尚存在許多不足之處，還需要更進(jìn)一步的探究。但本實(shí)驗(yàn)中涉及到轉(zhuǎn)基因技術(shù)已引起了研究人員的極大興趣，也許在不久的將來會(huì)有更廣闊的前景。因此繼續(xù)探索并完善基因修飾NSC移植治療SCI的理論水平和分子機(jī)制，從而使基因治療早日應(yīng)用于臨床，是我們進(jìn)一步研究的課題和努力的方向。

[1]Wang Y,Wang H, Tao Y,etal.NecroPtosis inhibitor necrostatin-1 Promotes cell Protection and Physiological function in traumatic sPinal cordinjury[J]. Neuroscience,2014,266:91-101.

[2]David S,LoPez-Vales R,Wee Yong V.Harmful and beneficial effects of inflammation after sPinal cord injury: Potential thera Peutic imPlications[J]. Handb Clin Neurol,2012,109:485-502.[3]Karimi-Abdolrezaee S, EftekharPour E.Stem cells and sPinal cord injury rePair[J].Adv ExP Med Biol,2012,760:53-73.

[4]Zlokovic BV, APuzzo ML. Cellular and molecular neurosurgery: Pathways from concePt to reality-Part II:vector systems and delivery methodologies for gene theraPy of the central nervous system[J]. Neurosurgery, 1997,40(4):805-813.

[5]訾英，范廣宇，朱悅.脊髓干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能的影響[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2006，23(10):1257-1258.

[6]Rahman F, Bhargava A,TiPPu SR,etal. Analysis of the immunoexPression of Ki-67 and Bcl-2 in the Pericoronal tissues of analysis[J]. Dent Res J(Isfahan), 2013,10(1):31-37.[7]Schulman JJ, Wright FA, Kaufmann T,etal.The Bcl-2 family member Bok binds to the couPling domain of inositol 1,4,5-trisPhate recePtors and Protects them from Proteolytic cleavage[J]. J Biol Chem,2013,288(35):25340-25349.

[8]Kontos CK,Fendri A,Khabir A,etal.Quantitative exPression analysis and Prognostic significance of the Bcl-2-associated X gene in nasoPharyngeal carcinoma: a retrosPective cohort study[J]. BMC Cancer,2013,13:293.

[9]張強(qiáng)，熊婷，張其梅,等.缺血后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27(3):329-330.

[10]燕景峰，岳長(zhǎng)波. BDNF基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2006，11(9):547-550.

[11]路艷，陳瑩，李宗斌，等.老齡大鼠心臟缺血預(yù)處理后熱休克蛋白27的變化研究[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(12):1308-1310.

Bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury in rats

ZHANG Mei1，WANG Yue-xin1*，HOU Xiao-hua1，HONG Jun1,YIN Sheng-chun1，LI Yan1，LIU Qing-yang2

(1. Tangshan Worker’s Hospital，Tangshan 063000，China；2.Coal General Hospital，Beijing 100028，China)

ObjectiveTo investigate the bcl-2 gene modification on neurological function recovery in rats with spinal cord injury in neural stem cell transplantation. Methods Cultured rat neural stem cells by Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection of neural stem cells were divided into 3 groups: control group, negative transfection group, bcl-2 transfection group. Use western-blot to detect the expression of bcl-2 protein in neural stem cells before and after transfection. 85 adult female SD rats, successful model 72, were randomly divided into control group, NSCs group, bcl-2-NSCs groups, 24/group, rat acute spinal cord injury model in accordance with a modified Allen’s method. Assess the motor function by BBB rating and the swash plate test. 7 days after modeling by RT-PCR and Western blot detection of spinal cord injury around HSP27, c - fos gene expression, TUNEL assay apoptosis. Four weeks after model drawn line HE staining and fluorescence microscopy EGFP-labeled NSC survival and distribution of the rats neurophysiological recovery by SEP and MEP.Resultsbcl-2 gene transfection of rat neural stem cells, bcl-2 transfection group and control group, negative transfection group compared to bcl-2 mRNA and protein levels were expressed (P< 0.05); lower extremity motor function in rats evaluation of bcl-2-NSCs group than NSCs group, NSCs group than the control group. 72 hours after modeling, bcl-2-NSCs number of apoptotic cells were significantly lower than the control group and NSCs group (P< 0.05). 7 days after modeling, compared with the control group and NSCs group, bcl-2-NSCs group HSP27 gene and protein expression was significantly higher than that (P< 0.05), bcl-2-NSCs group c-fos mRNA and protein expression was significantly reduced compared (P< 0.05). 4 weeks after modeling, HE staining control group showed spinal cord tissue loss and the formation of syringomyelia, no axonal through. NSCs group damage zone few of neuraxis-like structures, syringomyelia smaller, bcl-2-NSCs group showed more nerve axon-like structure, no syringomyelia. EGFP-positive cells labeled: bcl-2-NSCs group the most, NSCs group followed, no control group, and the difference between the groups was statistically significant (P< 0.05). After the 4th week, SEP and MEP latency period: bcl-2-NSCs group NSCs group> control group, and between the groups was significant difference (P< 0.05). Conclusions By Ad-EGFP as vector-mediated side B-cell lymphoma 2 gene (bcl-2) gene transfection make neural stem cells can promote cultured rat neural stem cells. bcl-2 gene-modified neural stem cell transplantation can promote the regeneration of spinal cord injury synaptic elevated HSP27 expression after spinal cord injury, reduced expression and neural cell apoptosis after spinal cord injury bcl-2 gene and improve limb movement in rats function and electrophysiological function.

Spinal cord injury;Bcl-2 gene; Modification; Neural stem cells;Transplantation;Repair;Rat;Nerve function

唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(15130254a)。

張梅(1980-)，女，本科，研究方向：脊柱脊髓損傷及其護(hù)理。E-mail：zhangmeiwang1@163.com。

王躍新(1979-)，男，碩士，研究方向：脊髓脊柱損傷。E-mail：m13102643830@163.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0035-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.006

2016-01-12