李彥紅，張繼剛，徐艷峰，韓云林，黃　瀾，江彬彬，朱　華，徐玉環(huán)，楊維玲*，秦　川*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京　100021；2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院,北京　100088)

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發(fā)光二極管光源照射日本大耳白兔皮膚的安全性評價

李彥紅1，張繼剛2，徐艷峰1，韓云林1，黃瀾1，江彬彬2，朱華1，徐玉環(huán)1，楊維玲2*，秦川1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京100021；2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院,北京100088)

目的通過LED白色光源照射日本大耳白兔皮膚組織，對LED光源照射的安全性進行初步的評價。方法動物隨機分成照射組和對照組。照射組動物剔除背部毛發(fā)，LED光源照射，強度為50 mw/cm2，對照組動物以普通日光燈光源照射，兩組均每天照射5 h，連續(xù)3個月。觀察動物皮膚有無紅腫，測量動物進食、體重、體溫等改變情況；照射完畢采集外周血測量常規(guī)、生化指標(biāo)；Elisa分析免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子改變情況；臟器組織病理檢測，及分析皮膚彈力纖維變化情況；皮膚免疫組織化學(xué)分析C-myc、P53、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)等癌基因及抑癌基因的表達變化。結(jié)果照射組兔皮膚未見紅腫表現(xiàn)，體重在6周后稍高于對照組，體溫3周、6周有差別，進食未見異常；血常規(guī)有白細(xì)胞增多，生化檢測尿素、肌酐水平有增高,但在正常范圍內(nèi)；ELISA分析血免疫細(xì)胞CD3T細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ水平在兩組無明顯差別，照射組動物CD19B細(xì)胞，IL-4水平升高；照射組動物臟器組織病理未見明顯異常結(jié)構(gòu)改變，皮膚彈性纖維分布無異常；皮膚組織內(nèi)細(xì)胞周期蛋白(CCND1)，C-Myc蛋白，P53蛋白表達與對照組相比沒有差異。結(jié)論LED光源照射日本大耳白兔3個月后，未引起體內(nèi)明顯的組織病理學(xué)改變，也未引起皮膚腫瘤相關(guān)因子的改變。

發(fā)光二極管；日本大耳白兔；皮膚；安全評價

發(fā)光二極管(light emitting diode, LED)為半導(dǎo)體固體發(fā)光器件，兩端加壓后，注入半導(dǎo)體中的載流子發(fā)生復(fù)合，引起光子發(fā)射而產(chǎn)生光[1]。隨著半導(dǎo)體工藝的快速發(fā)展，新型LED光源不斷推出，而且技術(shù)日益成熟，功率、發(fā)光效率不斷提高，光譜從紫外到紅外均已實現(xiàn)。LED光源具有冷光源、工作電壓低、功耗低、波長可調(diào)、綠色環(huán)保、壽命長等特點，已廣泛應(yīng)用于信號指示、裝飾照明、液晶背光燈領(lǐng)域，而且在醫(yī)學(xué)方面也開始應(yīng)用，如醫(yī)用照明、醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)學(xué)治療等方面[1]。但是關(guān)于LED光源的安全性問題研究的并不是很多，而且長時間照射是否會對機體造成潛在性的危害，均未見有明確報道。本文擬用LED光源照射日本大耳白兔3個月，觀察其生理生化及病理指標(biāo)，對LED光源照射的安全性進行初步的評價。

1　材料和方法

1.1實驗動物

普通級日本大耳白兔，6～8周齡，體重2.4～2.6 kg，雌雄各6只，購自北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心[SCXK(京)2013-0004]，動物在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所新藥安全評價中心普通級動物房[SYXK(京)2010-0030]飼養(yǎng)及管理，每天光照明暗各12 h，相對濕度40%～60%，溫度18～25℃，每籠1只，自由攝食和飲水。實驗操作已經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(zhǔn)(ILAS-PL-2014-005)。

1.2實驗材料

LED白色光源(GY225型，由山西光宇半導(dǎo)體照明股份有限公司提供)，功率50 mw/cm2，光通量4.5l m，距離2～2.5 m，光源可懸吊屋頂相當(dāng)于普通照明的方式連續(xù)照射。

1.3實驗方法

1.3.1光源照射

動物隨機分成兩組：實驗組：接受LED光源照射；對照組：以普通日光燈光源照射作為對照。動物剔除背部毛發(fā)，LED光源照射，距離2～2.5 m, 每天5 h，連續(xù)3個月；對照組動物以普通日光燈光源照射。每天5 h，連續(xù)3個月。

1.3.2臨床觀察

照射過程中觀察動物局部皮膚有無紅腫情況；觀察進食，每周記錄動物體重、體溫的改變，并比較。

1.3.3動物血液免疫學(xué)檢測

照射結(jié)束后，耳源靜脈采集動物外周血，檢測血常規(guī) (Rayto RT-7600S, USA)、生化(谷丙轉(zhuǎn)氨酶-ALT，尿素，血肌酐，膽固醇，甘油三脂，葡萄糖)[2]；ELISA分析兔外周血免疫細(xì)胞CD3(cluster differentiation 3) (QT-T98065, Qiyibio) T、CD19 (Ml027955,Mlbio) B細(xì)胞； 細(xì)胞因子IL(interleukin)-4 (CSB-E08745Rb,Cusabio)、IL-6(CSB-E06903Rb,Cusabio)、IFN(interferon)-γ(ER5400，solarbio)、TNF(tumor necrosis factor)-α(CSB-E06998Rb, Cusabio)等水平以明確動物免疫狀態(tài)的變化。1.3.4病理及免疫組織化學(xué)分析

照射結(jié)束后，動物用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)過量麻醉并放血致死，解剖取皮膚及其它組織，10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，進行病理檢測；皮膚彈力纖維染色分析真皮內(nèi)彈力纖維變化情況；免疫組織化學(xué)分析C-myc、P53、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)等癌基因及抑癌基因的表達變化。

蘇木素-伊紅(HE)染色：切片脫蠟至水，經(jīng)蘇木素染色,鹽酸酒精分化，氨水反藍后伊紅染色, 脫水透明封片,觀察組織病理改變。

皮膚彈性纖維染色(Gomori’s醛品紅)：切片脫蠟至水，經(jīng)高錳酸鉀溶液氧化，草酸漂白，水洗入染液(配制：堿性品紅1 g，70%酒精98 mL，三聚乙醛1 mL，濃鹽酸1 mL)15 min，70%酒精分化，0.5%橙黃G對比染色后脫水透明封片。

免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，封閉后加一抗C-myc(MD645-B,MDL),P53(ab194404,abcam),CCND1(ARP33370_P050,AVIVA SYSTEM BIOLOGY) ,4℃過夜，加相應(yīng)二抗(PV9001,PV9002,購自中杉金橋)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，流水沖洗后，脫水透明封片。觀察這些因子在兩組動物皮膚的表達水平。

1.4數(shù)據(jù)分析

2　實驗結(jié)果

2.1臨床觀察

動物在照射過程中，皮膚未見紅腫異常表現(xiàn)。兩組動物的進食、體重測量結(jié)果未見明顯異常；動物的體溫除第3周、6周改變有差異(P< 0.05)外，其余時間段比較無差異。(圖1)

注：*:P<0.05，與對照組相比。圖1　動物體重、飲食和體溫隨時間改變Note. *:P<0.05,compared with control group.Fig.1　The weight, diet and body temperature of animals changed with time

2.2常規(guī)生化檢測

血常規(guī)檢測照射組白細(xì)胞較對照組增多(P< 0.05)，中間細(xì)胞(白細(xì)胞中的嗜酸、嗜堿、單核細(xì)胞)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞也增多，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義。平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)和平均紅細(xì)胞容積(MCV)有所下降(P< 0.01)，但平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度并沒有異常改變，紅細(xì)胞分布變異系數(shù)(RDW-CV)升高(P< 0.01)。其余均未見異常改變。(圖2)

血生化檢測兩組動物血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)沒有明顯差異；血清尿素(UREA)和肌酐(CR)水平在照射組有所升高(P< 0.01)。(圖3)

2.3血液免疫學(xué)檢測

動物血液學(xué)檢測免疫細(xì)胞CD3T細(xì)胞含量兩組無差異，CD19B細(xì)胞在照射組升高(P< 0.05)；細(xì)胞因子檢測IL-4水平在照射組升高(P< 0.01)，IL-6,TNF-α，IFN-γ水平在兩組無明顯差別。(圖4)

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖2　血常規(guī)檢測Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.2　Blood routine test

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖3　血生化檢測Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.3　Hemorheological biochemical detection

注：*：P<0.05；**：P<0.01，與對照組相比。圖4　血液免疫學(xué)改變Note. *：P<0.05；**：P<0.01, Compared with control group.Fig.4　Hemorheological immunologic changes

圖5　皮膚蘇木素-伊紅(HE)和彈性纖維染色(Bar=100 μm)Fig.5　The htoxylin-eosin(HE)and elastic fiber staining of skin

2.4病理檢測

組織病理蘇木素-伊紅染色顯示，兩組動物皮膚各層結(jié)構(gòu)未見異常改變，層次清楚，少數(shù)皮膚真皮少量炎細(xì)胞浸潤；皮膚彈性纖維染色顯示分布無異常(圖5)；其余各臟器病理改變未見異常。

皮膚免疫組化檢測結(jié)果為細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1，CCND1)，C-Myc癌基因蛋白，P53抑癌基因表達蛋白兩組均無明顯差異。(圖6,7)

圖6　皮膚免疫組化染色(Bar=50 μm)Fig.6　The immunohistochemical staining of skin

圖7　皮膚免疫組化染色統(tǒng)計結(jié)果Fig.7　The statistical results of immunohistochemical staining in skin

3　討論

LED光源目前已在某些領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，甚至未來會替代傳統(tǒng)照明光源用于室內(nèi)照明，但我們應(yīng)該對LED光源的長時間使用的安全性進行初步的認(rèn)識和評價。本研究用LED白光照射日本大耳白兔3個月，觀察其生理、生化、免疫、病理指標(biāo)及致癌作用等方面進行初步觀察，或以后進行更長時間，更深入、系統(tǒng)的檢測來確定其使用系數(shù)的絕對安全性。

實驗組動物在照射過程中，LED光源對其體重、進食未引起明顯異常改變，體溫雖在某個階段與對照組存在差別，但體溫的測量值均在兔的體溫波動正常范圍內(nèi)[3]，因此改變無意義。

血常規(guī)檢測照射組動物白細(xì)胞增多，但據(jù)文獻報道兔的血白細(xì)胞正常值變化范圍為(5.5～12.5)×109/L[4],所測結(jié)果包含在此范圍內(nèi)，屬于正常。血常規(guī)中平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)是反映紅細(xì)胞形態(tài)特征的指標(biāo)，獨立的指標(biāo)改變不能作為疾病診斷的依據(jù)，需結(jié)合紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)相互參照才能用來判斷機體生理生化狀況[5]，而本研究中MCHC并未發(fā)現(xiàn)異常，MCV，MCH，RDW雖然兩組比較后有差異，但根據(jù)文獻[3，5]報道的這些指標(biāo)的參考值范圍，本實驗所測結(jié)果基本正常，所以改變的意義不大。照射3月后的實驗組兔血生化檢測肌酐、尿素氮水平較對照組增高，但文獻[5-7]報道的這些指標(biāo)參考值范圍均包含該實驗所測結(jié)果，因此兔的這些常規(guī)生化指標(biāo)的改變雖波動范圍大但正常。血液免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測結(jié)果CD19B淋巴細(xì)胞增多，IL-4增多，其余檢測指標(biāo)結(jié)果與對照組無差別。B淋巴細(xì)胞主要作用是產(chǎn)生抗體，參與體液免疫應(yīng)答并清除抗原，而IL-4可以促進B淋巴細(xì)胞增殖[8]，這說明動物體內(nèi)可能存在B細(xì)胞免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是機體的一種適應(yīng)和防御反應(yīng)。結(jié)合組織病理學(xué)結(jié)果，對照及實驗組動物均有皮膚、肺臟等少數(shù)組織出現(xiàn)輕度炎癥反應(yīng)，考慮原因可能為實驗操作、動物的應(yīng)激[9]、加之動物的個體差異，而引起動物機體的不同程度的炎癥反應(yīng)及表現(xiàn)。例如動物接受毛發(fā)修剪的過程中，固定架對動物身體的固定，及剃毛器對皮膚的刺激等，雖手法和其它條件一致，但不可避免會引起動物不同程度的掙扎、損傷及生理反應(yīng)改變，進而造成機體不同程度的免疫功能紊亂及炎癥反應(yīng)。

病理學(xué)檢測對照及實驗組動物除皮膚、肺臟等少數(shù)組織出現(xiàn)輕度炎癥反應(yīng)外，其余臟器均未見明顯異常器質(zhì)性病變。皮膚腫瘤相關(guān)因子的免疫組化檢測顯示兩組動物無明顯差別。細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1是細(xì)胞周期中短暫出現(xiàn)的原癌基因表達產(chǎn)物，具有嚴(yán)格的周期順序性，主要功能是促進細(xì)胞增殖，其過度表達可致細(xì)胞增殖失控而惡性化[10]，實驗證明在照射組和對照組表達無明顯差別，照射并未引起其過度表達；C-Myc癌基因是myc基因家族的重要成員之一，c-myc基因既是一種可易位基因，又是一種多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)節(jié)基因，C-myc基因的表達一般與細(xì)胞的生長狀態(tài)有關(guān)，C-myc與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其蛋白高表達在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖中起到重要作用[11],實驗表明兩組動物C-myc癌基因的表達也無明顯差異；P53是最重要的抑癌基因，對腫瘤細(xì)胞的凋亡具有促進作用，還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能[12]。正常條件下，P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的含量維持在一個較低的水平，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷或原癌基因突變激活時，細(xì)胞內(nèi)含量隨即升高，引發(fā)一系列下游段應(yīng)激反應(yīng)[13]。在各種腫瘤及細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中會高表達，P53突變和過度表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到一定的作用[14]。本實驗研究表明兩組動物皮膚P53蛋白均低表達或不表達。

綜上，LED白色光源照射日本大耳白兔3個月，某些常規(guī)生化指標(biāo)較對照組有差別，但不具有生理學(xué)意義；血液免疫指標(biāo)部分也存在差別，但不能排除動物因個體差異、操作及應(yīng)激致炎性病變后引起的免疫反應(yīng)，而且屬于輕度炎性反應(yīng)；組織學(xué)觀察未見明顯的病理性損傷；皮膚腫瘤學(xué)觀察未見相關(guān)腫瘤分子相對的異常表達；這些實驗表明LED光源照射3個月，未對動物身體造成明顯的病理損傷。但是將LED燈取代照明燈后更長時間的照射安全性問題，仍需進行深入系統(tǒng)的實驗研究。

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The safety assessment on the light emitting diode (LED) resource through irradiating the skin of Japanese big-ear white rabbits

LI Yan-hong1, ZHANG Ji-gang2, XU Yan-feng1, HAN Yun-lin1, HUANG Lan1,JIANG Bin-bin2, ZHU Hua1, XU Yu-huan1, YANG Wei-ling2*, QIN Chuan1*

(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health; Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine；Beijing key Laboratory for Animal Models of Emerging and Reemerging infectious Disease;Peking Union Medicine College, Beijing 100021, China; 2.The General Hospital of the PLA Rocket Force, Beijing 100088, China)

ObjectiveTo evaluate the safety of Light emitting diode (LED) source through irradiating the skin of Japanese big-ear white rabbits. Methods Animals were randomly divided into irradiated group and control group. Animals in the two groups were irradiated with LED light source after eliminating back hair (50mw/cm2) and the ordinary fluorescent lamp, respectively. The animals were irradiated for 5 hours every day for 3 months. The changes of animal skin symptoms, feeding, body weight, and temperature were observed and detected; the blood routine and biochemical indexes were tested; the changes of haematological immune cells and cytokines were analyzed by ELISA; histopathology and elastic fibers of skin were detected; the levels of C-myc, P53, and cyclin D1 in skin were tested by immunohistochemistry. ResultsThe skin of rabbits in irradiated group showed no abnormal change; the weight was higher than the control group animals at the 6th week, and the temperature had difference at the 3rd and 6th week, the diet showed no abnormal. Blood routine showed white blood cells increased; biochemical detection manifested urea and creatinine levels increased, but the indexes are in normal range; the hematological CD3T cells, cytokines IL-6,TNF-α and IFN-γ in the two group animals had no significant difference. The levels of CD19B cell and IL-4 level increased in irradiated group; The viscera histopathology structure and skin elastic fibers distribution in irradiated group animals showed normal; the expression of cell cycle protein 1 (CCND1), c-myc protein and P53 protein in skin of irradiated group had no difference with control. ConclusionsAfter irradiating 3 months, the LED light source had not caused the obvious pathology damage of tissues and change of skin tumor related factors to the rabbits.

Light emitting diode; Japanese big-ear white rabbit; Skin; Safety assessment

十二五重大科技專項(2012ZX10004-501)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題子任務(wù)(2003AA123310)。

李彥紅(1983-)，女，碩士，研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)。E-mail:liyanhong8408@163.com；張繼剛，男，副主任醫(yī)師。Email:jigang_zhang@sina.com。

秦川，女，教授。Email:qinchuan@pumc.edu.cn；楊維玲，女，主任醫(yī)師。Email:ywlderma@sina.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0024-07

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.004

2016-01-06