王延婷　李舒麗　楊鈺琪　高天文　李春英

NB-UVB對HaCaT細胞CCL22表達的影響

王延婷李舒麗楊鈺琪高天文李春英

目的： 明確NB-UVB對HaCaT細胞CCL22的影響。方法： 常規(guī)培養(yǎng)后的HaCaT細胞分為兩組，一組給予不同劑量NB-UVB（0、100、200、400 mJ/cm2）照射；一組給予NF-κB抑制劑PDTC（1、12.5、25 μmol/L）預處理后再進行NB-UVB照射，采用Real-time PCR及ELISA檢測CCL22表達；采用Western blot方法檢測NF-κB p65磷酸化水平。結果： CCL22表達和NF-κB p65磷酸化的水平隨著NB-UVB照射劑量增強而上調；PDTC處理后，NB-UVB誘導的角質形成細胞CCL22表達及和NF -κB p65磷酸化水平較直接給予NB-UVB明顯下調，且PDTC濃度越高越明顯。結論： NB-UVB照射可能通過激活NF-κB信號通路促進角質形成細胞CCL22表達及分泌。

窄譜中波紫外線； 角質形成細胞； CCL22

NB-UVB廣泛應用于多種炎癥性皮膚病如白癜風、銀屑病、蕈樣肉芽腫的治療，療效顯著且副作用小。目前關于NB-UVB治療皮膚病的作用機制，比較公認的觀點是其可直接作用于淋巴細胞誘導細胞凋亡并減少炎癥因子分泌［1］。最新研究提出，NBUVB可促進白癜風皮損局部Treg細胞數(shù)量增加，但具體機制不清［2］。CCL22作為Treg細胞皮膚遷移的重要趨化因子，在表皮中的表達水平對Treg皮膚遷移及后續(xù)功能至關重要。然而目前尚缺乏NB-UVB照射與CCL22表達關系的研究。本課題旨在體外細胞水平研究NB-UVB對角質形成細胞CCL22表達及分泌的影響，并探討可能機制。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑 UV-236B型紫外線光療儀為德國沃曼公司生產，燈管光譜值311 nm。HaCaT細胞系本室常規(guī)保存，1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。細胞總RNA提取試劑盒購自日本Takara公司。兔抗人CCL22抗體購自美國Abcam公司，鼠抗人NF-κB p65單抗、兔抗人磷酸化NF-κB p65單抗均購自Cell signaling technology公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG購自康為世紀生物科技公司。ELISA檢測試劑盒購自美國RD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及NB-UVB照射 HaCaT常規(guī)復蘇、傳代，使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將HaCaT細胞接種于6孔板（1×105個細胞/孔），待細胞生長至50%～60%融合時更換無血清培養(yǎng)基，16 h后去除培養(yǎng)基，加入200 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）后接受不同劑量NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）照射，照射后用PBS沖洗細胞2次，予以含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)特定時間點，收集細胞裂解液Real-time PCR檢測CCL22 mRNA及蛋白表達水平，收集上清液ELISA檢測培養(yǎng)基中CCL22的分泌水平。同上進行NB-UVB照射，予以含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測NF-κB活化情況。

2　結果

2.1NB-UVB照射誘導HaCaT細胞CCL22 mRNA表達及蛋白分泌情況 NB-UVB照射后細胞裂解液中CCL22 mRNA表達水平顯著升高，并呈現(xiàn)NB-UVB劑量依賴性（圖1a）。NB-UVB照射后細胞上清液中CCL22分泌水平顯著增強，與CCL22 mRNA表達變化一致（圖1b）；HaCaT細胞經(jīng)400 mJ/cm2NB-UVB照射后，收集不同時間點細胞上清，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CCL22分泌水平呈時間依賴方式顯著上調（圖1c）。以上結果提示，UVB照射以劑量和時間依賴方式促進角質形成細胞CCL22的表達及分泌。

圖1　a:NB-UVB照射HaCaT細胞后CCL22 mRNA表達（n=4，??P＜0.01，???P＜0.001）；b、c:NB-UVB照射HaCaT細胞后CCL22蛋白分泌（n=4，?P＜0.05，???P＜0.001）

圖2　NB-UVB照射HaCaT細胞后CCL22表達及NF-κB信號通路活化情況

2.2NB-UVB誘導HaCaT細胞CCL22表達信號活化情況 HaCaT細胞經(jīng)NB-UVB照射后2 h，隨著NB-UVB照射劑量增強，磷酸化的NF-κB p65水平顯著升高，同時CCL22蛋白表達水平也呈現(xiàn)上調趨勢（圖2），表明NF-κB p65信號活化可能參與NBUVB誘導角質形成細胞CCL22的表達。

2.3抑制NF-κB p65信號對NB-UVB誘導HaCaT細胞 CCL22 mRNA表達及蛋白分泌的影響 在HaCaT細胞接受400 mJ/cm2NB-UVB照射前，使用NF-κB活化的特異性抑制劑PDTC（1、12.5、25 μM）預處理30 min，發(fā)現(xiàn)PDTC預處理可明顯抑制NF-κB p65的磷酸化（圖3a），且PDTC預處理顯著抑制NBUVB對HaCaT細胞CCL22 mRNA的誘導效應，高劑量PDTC（12.5、25 μM）處理組更為明顯（圖3b）。ELISA檢測結果也顯示同樣的趨勢（圖3c）。以上結果提示NF-κB是NB-UVB誘導角質形成細胞CCL22表達及分泌的重要機制。

圖3　a:PDTC抑制NF-κB活化；b:PDTC抑制NB-UVB對HaCaT細胞CCL22 mRNA表達的誘導作用（n=3，?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001）；c:PDTC抑制CCL22蛋白的分泌（n=5，???P＜0.001）

3　討論

NB-UVB廣泛應用于臨床多種炎癥性皮膚病的治療。以往研究表明，NB-UVB抑制皮膚免疫炎癥反應的作用機制主要包括:抑制Th1細胞，調節(jié)Th1/ Th2的平衡；誘導淋巴細胞DNA損傷及凋亡，減少炎性細胞因子分泌；誘導真皮淺層朗格漢斯細胞凋亡、促進其向周圍淋巴結遷移，以及促進表皮IL-10分泌誘導Treg細胞分化，促進Treg細胞免疫抑制功能等［1，2］。近年來，由于 Treg細胞強大的免疫抑制作用，NB-UVB照射對Treg細胞的作用成了皮膚專家關注的重點。

CCL22是介導Treg細胞組織定向遷移的重要趨化因子。針對白癜風患者Treg細胞功能研究，發(fā)現(xiàn)即使是外周存在正常數(shù)量的Treg細胞及功能活性，但Treg細胞皮膚遷移能力降低，皮膚局部自身免疫不能被有效抑制導致疾病發(fā)生進展［3］。隨后 Klarquist等研究確定，白癜風患者皮損區(qū)Treg細胞浸潤減少源于表皮趨化因子CCL22表達分泌降低［4］。最近一項研究表明，對白癜風小鼠模型予以CCL22基因槍治療，可顯著增強Treg細胞皮膚遷移，有效抑制皮膚免疫，促進白斑復色［5］。我們的研究結果顯示，NB-UVB照射可以誘導角質形成細胞趨化因子CCL22表達上調，并促進其分泌。該結果為Hegazy等研究發(fā)現(xiàn)NB-UVB照射后白癜風皮損局部Treg細胞數(shù)量明顯增多提供了合理的解釋［2］。由此提示，NB-UVB照射誘導表皮角質形成細胞CCL22表達上調，促進了Treg細胞的皮膚遷移，從而抑制皮損局部免疫炎癥反應達到治療效果。

值得注意的是，Ekman等對比NB-UVB照射前后銀屑病患者外周趨化因子表達變化，發(fā)現(xiàn)NB-UVB對患者外周CCL22以及其他Th1、Th2、Th17型趨化因子均無顯著影響［6］。Shimauchi等也發(fā)現(xiàn)，NBUVB照射對蕈樣肉芽腫患者外周CCL22表達水平亦無影響［7］。由于趨化因子介導免疫細胞遷移遵循從低濃度向高濃度遷移原則，結合我們的研究結果，即NB-UVB照射誘導表皮CCL22表達上調，支持Treg細胞自外周向皮損組織遷移的可能性。但由于受臨床取材的限制，目前尚無NB-UVB治療前后皮損局部CCL22表達及Treg細胞浸潤的檢測，有待進一步研究。

以往研究證實，ERK、EGFR、p38 MAPK、JNK、NF -κB、STAT1均是角質形成細胞中誘導CCL22表達的重要信號機制［8，9］，各刺激條件決定不同的活化方式。本研究結果顯示，NB-UVB照射可激活NF-κB信號通路，且抑制NF-κB信號活化顯著下調CCL22 mRNA表達及蛋白分泌，表明NF-κB信號是角質形成細胞CCL22表達的關鍵信號機制，在NB-UVB治療炎癥性皮膚病中起重要作用。

綜上，本研究證實NB-UVB可通過活化NF-κB信號促進角質形成細胞表達分泌趨化因子CCL22，可能參與有效的促進Treg細胞皮膚遷移，從而抑制皮損局部自身免疫反應，達到臨床治療目的。

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［4］Klarquist J，Denman CJ，Hernandez C，et al.Reduced skin homing by functional Treg in vitiligo［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2010，23:276-286.

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（收稿:2016-01-13 修回:2016-01-27）

Effects of NB-UVB on the exPression of CCL22 in HaCaT cells

WANG Yanting，LI Shuli，YANG Yuqi，GAO Tianwen，LI Chunying.

Department of Dermatology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032，China Corresponding author:LI Chunying，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective:To determine the effects of NB-UVB on the expression of CCL22 from HaCaT cells. Methods:The cultrued HaCaT cells were divided into two groups.The HaCaT cells in one group were treated with different dose of NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）and those in the second group were treated with NB-UVB（400 mJ/cm2）after the pretreatment with PDTC.The expression of CCL22 was detected by Realtime PCR and ELISA.The level of NF-κB p65 phosphorylation was detected by western blot.Results:The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells treated with NB-UVB were increased as the dose of of NB-UVB was increasing.The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells pretreated by PDTC were lower than those treated with NB-UVB only and the higher the concentration of PDTC，the effects were more obvious.Conclusion:The CCL22 expression induced by NB-UVB in keratinocytes may through activation of NF-κB pathway.

NB-UVB；keratinocytes；CCL22

第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院，陜西西安，710032

李春英，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

1.2.2NF-κB抑制劑PDTC預處理實驗 HaCaT常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%融合時更換無血清培養(yǎng)基，實驗組予以NF-κB抑制劑PDTC（1，12.5，25 μmol/L）預處理30 min，對照組予以DMSO處理，之后進行400 mJ/cm2NB-UVB照射。培養(yǎng)24 h后收集細胞裂解液及上清檢測CCL22 mRNA表達及分泌。

1.2.3Real-time PCR檢測CCL22的表達 Trizol試劑提取細胞RNA，按照試劑盒說明反轉錄成cDNA后進行qRT-PCR檢測。CCL22引物設計及合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，上游引物:5’-ATCGCCTACAGACTGCACTC-3’，下游引物:5’-GACGGTAACGGACGTAATCAC-3’。β-actin為內參。

1.2.4Western blot印跡檢測CCL22及NF-κB信號通路活化情況 收集實驗處理組及對照組HaCaT細胞，RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（5%濃縮膠，12%分離膠）。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后轉膜。轉膜后用TBST稀釋的5%脫脂奶粉室溫封閉1～4 h，予NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、CCL22及β-actin等一抗4℃孵育過夜。次日予以辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育50 min。使用化學發(fā)光儀檢測結果。

1.2.5ELISA檢測CCL22表達 收集實驗組及對照組細胞上清，嚴格按照ELISA檢測試劑盒操作說明檢測CCL22分泌水平。

1.2.6統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計軟件進行分析。組間檢驗采用one-way anova檢驗法，各組數(shù)據(jù)兩兩比較，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。