謝　璟　鄭炎焱

楊梅黃酮對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響

謝璟鄭炎焱

目的： 明確楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響。方法： 原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞加入不同濃度（0，10，25，50，75，100 μM）的楊梅黃酮，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性和膠原合成。結(jié)果： 楊梅黃酮濃度為10 μM及25 μM時(shí)成纖維細(xì)胞增殖活性明顯增加；濃度高于50 μM處理后的成纖維細(xì)胞增殖活性降低，I型膠原表達(dá)減少。結(jié)論： 楊梅黃酮大于50 μM時(shí)能抑制成纖維細(xì)胞膠原合成，提示該藥具有較好的抗皮膚和內(nèi)臟器官纖維化作用，為治療纖維化相關(guān)疾病提供了一定的理論依據(jù)。

成纖維細(xì)胞；楊梅黃酮；膠原

楊梅黃酮廣泛存在于楊梅中，楊梅素（myricetin，Myr）化學(xué)名稱為3，5，7，3'，4'，5'-六羥基黃酮，是黃酮類化合物。廣泛存在于雙子葉植物，特別是一些木本植物的花和葉中，溶于甲醇、乙醇、丙酮，不溶于氯仿、石油醚，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、防止血小板聚集等多種生物活性［1，2］。有研究表明黃酮類藥物能依賴性地抑制細(xì)胞內(nèi)膠原合成，表明其在體外也有抗纖維化作用［3］，可為抗纖維化藥物研究提供理論依據(jù)。本研究結(jié)合纖維化的病理生理機(jī)制，從細(xì)胞及分子水平重點(diǎn)研究楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響，以尋找治療增生性瘢痕等纖維化相關(guān)疾病的有效藥物。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器 楊梅黃酮購(gòu)自杭州和田生物技術(shù)有限公司，純度＞98%，將其用DMSO溶解，-20℃避光保存；二甲基亞砜（sigma公司）；MTT（sigma公司）；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；人I型膠原試劑盒（美國(guó)Uscnlife公司）；ELITEESP流式細(xì)胞儀（Beckman公司）；DU-800型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）；PI染液（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2方法

1.2.1原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 材料取自健康男子包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮，用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第3～5代［4］。

1.2.2改良MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性用不同濃度楊梅黃酮組（0，10，25，50，75，100 μM），處理人皮膚成纖維細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，向每孔加入MTT溶液10 μL，選擇490 nm波長(zhǎng)，在自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收（A）值。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量影響的測(cè)定 將人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）以5×107/L的細(xì)胞密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積 1 mL，加入含不同濃度楊梅黃酮的DMEM培養(yǎng)液，每個(gè)試劑濃度測(cè)4個(gè)孔，加藥后48 h，從每個(gè)孔里各吸取 0.5 mL培養(yǎng)基，按羥脯氨酸（HPR）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)A值，樣品中羥脯氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）=測(cè)定管A值×標(biāo)準(zhǔn)管濃度/標(biāo)準(zhǔn)液A值。

1.2.4對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中I型膠原蛋白影響的測(cè)定 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按I型膠原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)得到I型膠原含量。

1.2.5楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期影響的檢測(cè) 取第3～7代人皮膚成纖維細(xì)胞，以1×108/L的密度接種于直徑25 cm培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，加入楊梅黃酮濃度分別為0，10，25，50，75，100 μM含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每個(gè)濃度2瓶細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 全部資料用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件錄入和統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布資料用ˉx±s表示；對(duì)于重復(fù)測(cè)量的MTT值，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析；對(duì)于人I型膠原蛋白測(cè)定值、羥脯氨酸值的分析，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析；當(dāng)多個(gè)總體均數(shù)不全相同時(shí)，采用SNK法或LSD法進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較。

2　結(jié)果

2.1不同濃度楊梅黃酮處理24 h、48 h、72 h后測(cè)量MTT值 應(yīng)用MTT比色法測(cè)定人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活力，結(jié)果見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，楊梅黃酮濃度為10，25 μM時(shí)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活力增加，濃度大于50 μM楊梅黃酮作用后人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活力降低，差別具有非常顯著性意義（P＜0.01）。

表1　不同濃度楊梅黃酮處理后MTT值測(cè)定結(jié)果

表1　不同濃度楊梅黃酮處理后MTT值測(cè)定結(jié)果

加藥濃度（μM）　n　　不同時(shí)間的MTT值24 h　48 h　72 h 0　6　0.261±0.009　0.354±0.012　0.539±0.010 10　6　0.287±0.006　0.394±0.008　0.576±0.005 25　6　0.312±0.010　0.402±0.009　0.612±0.007 50　6　0.235±0.008　0.216±0.010　0.189±0.008 75　6　0.193±0.010　0.132±0.009　0.107±0.007 100　6　0.083±0.010　0.052±0.009　0.030±0.007

2.2I型膠原蛋白測(cè)定值分析 對(duì)不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中人I型膠原蛋白測(cè)定值進(jìn)行方差分析。A、B、C三孔測(cè)定值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F區(qū)組=1.815，P=0.213），不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中人I型膠原蛋白測(cè)定值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=539.848，P＜0.001），且各處理組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SNK法，P＜0.05），其人I型膠原蛋白測(cè)定值隨楊梅黃酮加藥濃度（大于50 μM時(shí)）升高而逐漸變?。ū?）。

2.3不同濃度楊梅黃酮作用48 h后成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量影響的方差分析 不同濃度楊梅黃酮對(duì)羥脯氨酸含量影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F處理=379.711，P＜0.001），且各處理組兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SNK法，P＜0.05）。在楊梅黃酮濃度大于50 μM時(shí)，羥脯氨酸含量隨楊梅黃酮加藥濃度升高而逐漸減少（表3）。

表2　I型膠原蛋白測(cè)定值

表2　I型膠原蛋白測(cè)定值

藥物　不同加藥濃度I型膠原蛋白測(cè)定值0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM楊梅黃酮　2.9625±0.0328　3.1026±0.0602　3.2737±0.0146　1.8638±0.0413　1.6532±0.0180　0.5772±0.1375

表3　楊梅黃酮作用后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量測(cè)定值

表3　楊梅黃酮作用后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量測(cè)定值

藥物　　不同楊梅黃酮濃度中羥脯氨酸含量0 μM　10 μM　25 μM　50 μM　75 μM　100 μM楊梅黃酮　53.42±1.43　55.16±1.43　59.14±1.85　28.28±1.63　21.72±1.14　7.71±1.43

2.4楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定0，50，75，100 μM楊梅黃酮作用48 h后成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期及各期所占的百分比，可以看出，濃度大于50 μM時(shí)隨著楊梅黃酮藥物濃度的增加，G/G期細(xì)胞數(shù)量增加，G/M期和S期細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）逐漸減?。ū?）。

表4　成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期各期所占百分比

3　討論

纖維化（fibrosis）可發(fā)生于多種器官，主要病理改變?yōu)槠鞴俳M織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命［5］。雖然組織纖維化誘發(fā)因素多樣、發(fā)生器官不同、臨床表現(xiàn)各異，但是它們的發(fā)生和發(fā)展都是因?yàn)榻M織損傷后組織修復(fù)過(guò)程失調(diào)或更直接地說(shuō)是組織修復(fù)反應(yīng)過(guò)度的結(jié)果。這些過(guò)度修復(fù)包括成纖維細(xì)胞的激活增殖及細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）-如膠原蛋白、蛋白多糖等成分過(guò)度的沉積等現(xiàn)象［6］。皮膚組織的纖維化可見(jiàn)于增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF），二者均是皮膚創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理現(xiàn)象，其病理本質(zhì)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞基質(zhì)過(guò)度沉積，其中膠原主要由成纖維細(xì)胞合成分泌產(chǎn)生，因此后者的數(shù)量和功能狀態(tài)在很大程度上決定了增生性瘢痕（HS）和瘢痕疙瘩（HKF）纖維化的程度［7］，通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞（FB）凋亡有望成為有效防治病理性瘢痕的新亮點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的楊梅黃酮，觀察楊梅黃酮對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響，以尋找治療人增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的有效藥物。

黃酮類天然產(chǎn)物是近年來(lái)天然藥物和人類健康產(chǎn)品研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，從藥用植物和經(jīng)濟(jì)植物中開(kāi)發(fā)生理活性黃酮成分作為天然藥物和保健品的原料已日益引起重視。楊梅為我國(guó)特產(chǎn)資源，鑒于地區(qū)差異，目前國(guó)際上對(duì)楊梅的研究剛剛起步，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、消除體內(nèi)自由基等多種藥理活性［8-11］。楊梅屬植物在我國(guó)分布較廣，不同種的不同部位均有入藥，其抗腫瘤、抗氧化活性研究較多，并取得了一些良好的成果，為楊梅黃酮抗纖維化研究提供理論依據(jù)。本研究結(jié)合纖維化的病理生理機(jī)制，從細(xì)胞及分子水平重點(diǎn)觀察楊梅黃酮抗成纖維細(xì)胞膠原合成作用。結(jié)果表明，楊梅黃酮在高濃度時(shí)可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞羥脯氨酸分泌，進(jìn)而使細(xì)胞I型膠原蛋白的合成下降來(lái)干預(yù)纖維化進(jìn)程；另外，高濃度楊梅黃酮還可通過(guò)影響人皮膚成纖維細(xì)胞周期，抑制靜止?fàn)顟B(tài)的G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量減少，從而抑制細(xì)胞的增殖。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮在低濃度時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)反而具有促進(jìn)作用，可能與其抗氧化作用有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明楊梅黃酮在一定濃度范圍內(nèi)能抑制成纖維細(xì)胞膠原合成，提示該藥具有較好的的抗皮膚和內(nèi)臟器官纖維化作用，為其治療纖維化相關(guān)疾病提供了一定的理論依據(jù)。

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（收稿:2015-11-25 修回:2015-12-12）

Effect of myricetin on Proliferation and collagen synthesis of human fibroblasts

XIE Jing，ZHENG Yanyan.

Wenzhou People's Hospital，Wenzhou 325000，China

Objective:To determine the effect of myricetin on cell proliferation and collagen synthesis of human fibroblast.Methods:The primary cultured fibroblasts in vitro were isolated and treated with myricetin in different concentration（0，10，25，50，75，100 μM）.Cell cycle was measured by flow cytometry.The fibroblasts proliferation and the expression of collagen type I was assessed by MTT assay.Results:The cellular viability of fibroblast was increased in the dose of 10 μM and 25 μM of myricetin，and was decreased in the dose of 50 μM or above.Conclusion:The proliferation and collagen synthesis of human fibroblast can be inhibited when the concentration of myricetin is higher than 50 μM，which provides a theoretical base for the treatment of fibrosis diseases.

fibroblast；myricetin；collagen

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào):2014S0053）

浙江省溫州市人民醫(yī)院，325000