王　立　張力元　冀勝軍　季　江　冷　紅蘇玉華

·短篇論著·

電離輻射對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響

王立1張力元2冀勝軍3季江2冷紅2蘇玉華2

目的： 明確電離輻射對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（KFb）增殖的影響。方法： MTT比色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同劑量電離輻射照射前后KFb形態(tài)、增殖和存活力變化；通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量，明確處理前后膠原總體水平變化。結(jié)果： 4Gy X-Rays作用72 h后，KFb增殖抑制率為（47.88±1.82）%高于正常皮膚成纖維細(xì)胞（39.86±0.07）%（P＜0.05）；KFb細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，KFb細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量照射72 h后為（11.749±0.9428）μg/mL高于照射前的（18.689 ±0.8484）μg/mL（P＜0.05）。結(jié)論： 電離輻射能夠抑制KFb細(xì)胞的增殖及膠原的產(chǎn)生。

電離輻射； 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞； 膠原

瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復(fù)的結(jié)果，對(duì)各種治療抵抗，由于其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前已成為皮膚科和整形美容外科治療較為棘手的難題之一。主要治療方法有手術(shù)切除，放療，藥物治療，壓迫治療，硅膠敷貼，激光及冷凍治療等。但迄今為止，各種方法治療后都存在一定的復(fù)發(fā)率，無(wú)一單獨(dú)有效的治療方案［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)，放療在瘢痕疙瘩治療中占有很重要的地位，手術(shù)切除后放療是目前最有效的治療方案，復(fù)發(fā)率一般在20%左右，而復(fù)發(fā)率和電離輻射的總劑量顯著相關(guān)［3-8］。然而潛在的機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究目的在于闡明電離輻射治療瘢痕疙瘩的相關(guān)機(jī)制，為預(yù)防瘢痕疙瘩早期復(fù)發(fā)提供思路。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。標(biāo)本取自整形美容外科和皮膚科手術(shù)患者，并征得患者書(shū)面同意。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床和病理確診瘢痕疙瘩患者，病程超過(guò)1年，皮損超過(guò)傷口范圍，呈浸潤(rùn)持續(xù)生長(zhǎng)，有發(fā)紅、癢、痛等臨床癥狀；未經(jīng)手術(shù)、激光、冷凍、糖皮質(zhì)激素皮損內(nèi)注射等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：正常瘢痕、增生性瘢痕、年齡大于60歲的患者。正常人標(biāo)本取自美容手術(shù)無(wú)相應(yīng)疾病患者。

1.2 瘢痕疙瘩患者皮損及正常皮膚原代成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用原代分散細(xì)胞培養(yǎng)法，具體步驟如下：局麻下切取瘢痕疙瘩皮損組織或正常皮膚標(biāo)本，去除皮下脂肪組織，置中性蛋白酶（Dispase II 2 U/mL，德國(guó)羅氏試劑）、膠原酶（200 U/L）（美國(guó)Sigma公司）溶液中，37℃水浴4 h，分離表真皮；將分離的真皮剪碎，放入膠原酶（200 U/L）溶液中，37℃水浴3 h，消化分散成纖維細(xì)胞；收集消化分散的成纖維細(xì)胞液，加一定量的完全培養(yǎng)液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾的細(xì)胞懸液，低速離心；洗后細(xì)胞種植于50 mL培養(yǎng)瓶，加入含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)；每2～3天換液1次，待梭形的成纖維細(xì)胞布滿瓶底時(shí)，以0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液消化細(xì)胞并傳代增殖。以下所有實(shí)驗(yàn)選用第4～7代細(xì)胞。原代成纖維細(xì)胞采用免疫熒光鑒定，4%多聚甲醛固定，加0.3%Tritonx-100破細(xì)胞膜，血清封閉，加入鼠抗人波形蛋白（vimentin，美國(guó)Abcam公司）一抗孵育2 h，PBS洗滌后加入羊抗鼠熒光二抗孵育1 h，最后再進(jìn)行DAPI復(fù)染核，熒光顯微鏡觀察，陰性對(duì)照不加一抗。

1.3照射條件 于室溫下以6MV X射線照射，劑量率為3 Gy/min；照射源至標(biāo)本距離100 cm，劑量為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy及8 Gy。

1.4瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞照射前后增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè) CCK-8法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖情況，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，5%CO2、37℃孵育，每孔加入10 μL CCK-8溶液（美國(guó)Dojindo分子技術(shù)公司），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD450 nm處測(cè)量各孔的吸光值。收集照射前后貼壁和漂浮的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)板計(jì)算活細(xì)胞率。

1.5瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞照射前后細(xì)胞周期分布檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)相應(yīng)處理后，0.25%胰酶消化細(xì)胞，加培養(yǎng)基終止消化，混勻，收集到15 mL離心管中。離心去上清液，加入-20℃無(wú)水乙醇3 mL，快速震蕩混勻，冰盒儲(chǔ)存送檢，加 100 μg/mL RNA酶，50 μg/mL PI，37℃孵育0.5 h，上機(jī)檢測(cè)。

1.6電離輻射對(duì)KFb膠原合成的影響 成纖維細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，按4×104/孔密度接種24孔板。培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)72 h后，從每個(gè)孔各吸取1 mL培養(yǎng)基上清液，按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量，計(jì)算每株細(xì)胞照射后不同時(shí)間測(cè)得的膠原濃度，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，兩組間比較采用最小顯著差法（LSD），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1入選患者及正常人一般情況 本項(xiàng)研究中瘢痕疙瘩患者12例，其中男6例，女6例；年齡12～49歲，平均（34.78±9.83）歲；病程16～110個(gè)月，平均發(fā)病時(shí)間（35.68±12.72）個(gè)月；瘢痕疙瘩主要分布在前胸、肩背、頸項(xiàng)、耳廓部等。對(duì)照組入選12例，其中男5例，女7例；年齡18～42歲，平均（38.09±6.34）歲。患者組與對(duì)照組在性別及年齡構(gòu)成比差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

2.2原代成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 消化分離的成纖維細(xì)胞可在體外快速貼壁生長(zhǎng)、增殖，約2周左右原代細(xì)胞鋪滿瓶底，即傳代，傳代比例1∶3，傳代后細(xì)胞形態(tài)較清楚，胞體細(xì)長(zhǎng)呈長(zhǎng)梭形，核卵圓形居中，細(xì)胞呈柵欄狀，漩渦狀生長(zhǎng)，3天后長(zhǎng)滿。免疫熒光染色顯示：培養(yǎng)的細(xì)胞核呈藍(lán)色，卵圓形，胞質(zhì)呈綠色紅色熒光，Vimentin表達(dá)陽(yáng)性。

2.3細(xì)胞增生、細(xì)胞存活和細(xì)胞周期檢測(cè) 將同樣數(shù)量的KFb和NFb分別種入96孔板中，分別在24 h、48 h、72 h和96 h測(cè)定細(xì)胞增殖能力。電離輻射明顯抑制KFb的增殖，存在劑量和時(shí)間依賴模式，4Gy X-Rays 72 h對(duì)KFb的細(xì)胞增殖抑制率為47.88%± 1.82%。我們還利用光鏡觀察法和臺(tái)盼藍(lán)染色法分別觀察了電離輻射對(duì)KFb細(xì)胞的作用。電離輻射后KFb細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，如細(xì)胞核增大，扁平，細(xì)胞間隙增大（圖1）。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果也顯示，電離輻射能明顯地抑制KFb細(xì)胞的活力。此外，我們采用PI染色觀察了電離輻射后KFb細(xì)胞周期的分布變化，照射后G0/G1比例逐漸增高，出現(xiàn)G1期阻滯（圖2）。

2.4KFb細(xì)胞4Gy X-Rays輻照后72 h膠原表達(dá)采用羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定KFb細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量，輻照后72 h與未輻照對(duì)照組膠原濃度分別是（11.749±0.9428）μg/mL和（18.689± 0.8484）μg/mL（P＜0.05）。

圖1　1a：電離輻射對(duì)NFb細(xì)胞形態(tài)的影響；1b：電離輻射對(duì)KFb細(xì)胞形態(tài)的影響；1c：電離輻射對(duì)NFb細(xì)胞活力的影響；1d：電離輻射對(duì)KFb細(xì)胞活力的影響

圖2　4 Gy照射KFb細(xì)胞后，隨時(shí)間延長(zhǎng)G0/G1期比例逐漸增高，出現(xiàn)G1期阻滯，而G2/M期比例逐漸降低

3　討論

瘢痕疙瘩（keloid，K）因其所具備的持續(xù)性生長(zhǎng)、無(wú)自限性、切除后易復(fù)發(fā)和向正常皮膚侵襲生長(zhǎng)的臨床特點(diǎn)，目前作為一種腫瘤而進(jìn)行研究。1，2瘢痕疙瘩組織由細(xì)胞成分和細(xì)胞外基質(zhì)成分（ECM）構(gòu)成。細(xì)胞成分對(duì)瘢痕疙瘩的生物學(xué)行為起決定作用。瘢痕組織內(nèi)最主要的功能細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的異常增殖、分泌過(guò)多細(xì)胞外基質(zhì)的特征性生物學(xué)行為，可能是瘢痕疙瘩形成過(guò)程中的重要因素，KFb不受正常細(xì)胞周期控制時(shí)，增殖將超過(guò)凋亡［1，7-9］。

在我們的系列研究中，KFb和正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NFb）來(lái)自年齡和性別相匹配的不同個(gè)體。前期研究提示兩種細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面沒(méi)有顯著區(qū)別，但在細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，KFb細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于NFb細(xì)胞，有更多的I型膠原產(chǎn)生，這些結(jié)果與既往研究相似［1，2，12，14］。瘢痕疙瘩是創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中結(jié)締組織異常增生的結(jié)果。前期研究表明KFb在細(xì)胞增殖及DNA合成代謝等多個(gè)方面，均明顯高于健康人皮膚成纖維細(xì)胞NFb，細(xì)胞周期檢測(cè)表明KFb存在G2/M期阻滯［12，9］。

為進(jìn)一步探討電離輻射抑制瘢痕疙瘩皮損復(fù)發(fā)的機(jī)制，通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)，我們檢測(cè)了不同劑量X線照射KFb后不同時(shí)間的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。電離輻射能抑制KFb細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制膠原的產(chǎn)生，誘導(dǎo)KFb細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。電離輻射對(duì)瘢痕疙瘩患者的療效歸因于對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的損傷作用。細(xì)胞核DNA是電離輻射的目標(biāo)靶位，DNA損傷致使細(xì)胞周期停止、凋亡、衰老或其他細(xì)胞學(xué)改變，不同劑量或作用后的不同時(shí)期，其細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)可能不盡相同［4-12］。一些文獻(xiàn)報(bào)道電離輻射能夠誘導(dǎo)DNA甲基化模式發(fā)生改變，但對(duì)特定基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的影響及通過(guò)何種途徑作用，目前尚不清楚。而我們之前的研究已經(jīng)表明瘢痕疙瘩皮損及其成纖維細(xì)胞p16基因低表達(dá)，其啟動(dòng)區(qū)CpG島中存在甲基化現(xiàn)象［13，14］，電離輻射是否通過(guò)誘導(dǎo)其甲基化模式的改變來(lái)發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，基于我們的細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)，認(rèn)為電離輻射能夠控制KFb細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制膠原合成，可能是電離輻射抑制瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)的效應(yīng)機(jī)制。

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（收稿：2015-05-19 修回：2015-06-26）

Effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts

WANG Li1，ZHANG Liyuan2，JI Shengjun3，JI Jiang2，LENG Hong2，SU Yuhua2.
1.Xietang People's Hospital No.1 Lotus Community Medical Service，Suzhou Industrial Park，Suzhou，215004；2.Second Hospital Affiliated to Soochow University，Suzhou 215004，China；3.Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou 215002，China Corresponding author：JI Jiang，E-mail：jijiang2222@126.com

Objective：To determine the effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts（KFb）.Methods：The cllular morphology，viability，proliferation and cell cycle of KFb before and after ionizing radiation were detected by MTT and flow cytometry.The change of the collagen level before and after treatment was measured by detecting the level of the hydroxyproline in the supernatant of the co-culture. Results：The proliferation inhibition rate of KFb after 4Gy irradiation for 72 hours was（47.88±1.82）%which was higher than that of normal skin fibroblast（39.86±0.07）%，（P＜0.05）.The cellular morphology of KFb was abnormal.The level of hydroxyproline was（11.749±0.9428）μg/mL and（18.689±0.8484）μg/mL before and after irradiation for 72 hours respectively（P＜0.05）.Conclusion：Ionizing radiation inhibits the proliferation of KFb and the generation of collagen.

ionizing irradiation；keloid fibroblast；collagen

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（編號(hào)：81472804；81402517）江蘇省自然青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：BK20130277）

1蘇州工業(yè)園區(qū)斜塘人民醫(yī)院蓮花第一社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，215000

2蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，蘇州，215004

3南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，215002

季江，E-mail：jijiang2222@126.com