褚雪蓮　嚴(yán)麗英

[摘要]目的：探討梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）抗體在診斷新生兒梅毒中的應(yīng)用。方法：分別用甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）、TP-ELISA和密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（TPPA）法對(duì)84例確診新生兒梅毒患者與100例健康新生兒血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：三種檢測(cè)梅毒螺旋體抗體方法的靈敏度分別為51.2%、98.8%和100%，相對(duì)而言，TRUST法不適合作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗(yàn)。結(jié)論：TP-ELISA法靈敏度與特異性相對(duì)較高，操作簡(jiǎn)便易行，建議作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗(yàn)；TPPA法由于操作繁瑣復(fù)雜，可結(jié)合臨床作為新生兒梅毒的確診試驗(yàn)。

[關(guān)鍵詞]梅毒螺旋體抗體；新生兒梅毒；甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)；雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)

[中圖分類號(hào)]R759.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

蒼白密螺旋體（treponema pallidum，TP）蒼白亞種，又稱梅毒螺旋體，是性傳播疾病梅毒的病原體。人類是梅毒螺旋體的唯一傳染源，性接觸直接傳染是最主要的傳播途徑，但患梅毒的孕婦可經(jīng)胎盤感染胎兒，多發(fā)生于妊娠4個(gè)月之后。通過胎盤梅毒螺旋體進(jìn)入胎兒血流，經(jīng)血流擴(kuò)散至全身，發(fā)生全身性感染，并在肝、脾、腎上腺等處大量生長(zhǎng)繁殖，致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎的發(fā)生。而晚期感染成活的胎兒患有先天性梅毒（congenitalsyphilis，CS），常出現(xiàn)特殊體征如馬鞍鼻、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾、鋸齒形牙等。妊娠期梅毒常無(wú)明顯癥狀，為潛伏梅毒，而新生兒先天性梅毒易誤診漏診，使新生兒身體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。為了控制與避免梅毒螺旋體感染對(duì)新生兒造成巨大危害，控制先天性梅毒的發(fā)病率，規(guī)范、嚴(yán)格的產(chǎn)前梅毒篩查和先天性梅毒的早期診斷則顯得尤為重要。臨床癥狀和梅毒血清學(xué)檢測(cè)是目前臨床上對(duì)新生兒梅毒進(jìn)行診斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。新生兒先天梅毒有多種臨床表現(xiàn)，癥狀體征缺乏特異性，并可造成多臟器累及。另外，發(fā)生漏診或者誤診，往往是由于父母不知情，或者故意隱瞞梅毒病史。梅毒螺旋體侵入人體后刺激人體產(chǎn)生兩類抗體，分別為宿主對(duì)螺旋體表面的脂質(zhì)做出應(yīng)答產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原抗體，與B細(xì)胞產(chǎn)生的IgM、IgG兩種特異性梅毒螺旋體抗體。梅毒血清學(xué)檢測(cè)根據(jù)使用抗原不同，分非特異性類脂質(zhì)抗原檢測(cè)與特異性密螺旋體抗原檢測(cè)兩大類，非特異性脂質(zhì)抗原檢測(cè)主要用于對(duì)梅毒的初步篩查，包括不加熱血清反應(yīng)素（USR）、快速血漿反應(yīng)素（RPR）及甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）等；特異性密螺旋體抗原檢測(cè)使用的抗原是梅毒螺旋體的特異成分，主要包括熒光密螺旋體抗體吸收（FTA-ABS）、密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（TPPA）和膠體金法，這些方法常用于確診梅毒感染。由于母體IgM抗體不能通過胎盤，而胎兒B細(xì)胞只能產(chǎn)生IgM，出生3個(gè)月后才能合成IgG，故TP-IgM抗體檢測(cè)是新生兒先天性梅毒早期診斷最理想的方法。本研究對(duì)比討論了不同梅毒螺旋體抗體檢測(cè)方法在診斷新生兒梅毒中的特點(diǎn)與臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院新生兒科2006年4月至2014年5月確診梅毒的新生兒84例及新生兒母親84例作為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、病理學(xué)檢查確診為梅毒患者，符合《2015美國(guó)疾病控制中心性傳播疾?。范荆┲委熤改稀罚唬?）患者可出現(xiàn)硬下疳、多形性皮損等臨床表現(xiàn)：（3）患者簽署知情同意書，自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、肝、腎等其他器官嚴(yán)重器質(zhì)性病變患者：（2）意識(shí)不清及精神疾病患者。其中確診為梅毒新生兒年齡1h～14d；男44例，女40例。同時(shí)選擇我院健康新生兒100例作為對(duì)照?；純耗挲g為1h～6d。均采集空腹靜脈血（無(wú)溶血、脂血）2 3mL，離心分離血清-20℃保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 TRUST試劑盒（上海榮盛生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：140123），TP-ELISA試劑盒（廈門英科新創(chuàng)科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：140319），TPPA試劑（日本富士瑞必歐株式會(huì)社珠海麗珠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：VN40628）。

1.2.2 TRUST試驗(yàn) 該試驗(yàn)以包被有心磷脂的膽固醇做為載體，與血清中的非特異性抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成膠體微粒。血清中的抗體，與混懸于甲苯膠紅溶液中的抗原微粒反映出現(xiàn)肉眼可見的粉紅凝集塊即判斷為陽(yáng)性。按試劑盒說明書要求，按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行倍比稀釋，觀察呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度報(bào)告梅毒血清TRUST滴度。

1.2.3 TP-ELISA法檢測(cè) 該檢測(cè)方法使用超聲波擊碎的Nichol株為抗原，用雙抗原夾心ELISA法，來檢測(cè)TP抗體是否存在于待測(cè)血清中。將高純度TP特異抗原包被于微孔反應(yīng)板中，加入標(biāo)本血清和酶標(biāo)的高純度TP抗原，形成TP抗原-TP抗體一酶標(biāo)TP抗原夾心復(fù)合物。利用酶底物/色原液（過氧化脲/TMB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色強(qiáng)度與TP抗體水平成正比。試驗(yàn)操作依據(jù)試劑說明書要求，然后酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm，空白孔調(diào)零，測(cè)定OD值，OD值/cutoff值≥1判定為陽(yáng)性，OD值/cutoff值<1則判定為陰性，臨界值=陰性對(duì)照OD均值×2.8。

1.2.4 TPPA法檢測(cè) 該試驗(yàn)是用明膠顆粒包被梅毒螺旋體Nichols株的精致菌體成分制成的致敏顆粒來檢測(cè)TP抗體，當(dāng)樣本中的TP抗體與該顆粒結(jié)合時(shí)可發(fā)生凝集，不管是均一顆粒凝集或是較大的環(huán)狀凝集均可判斷為陽(yáng)性。當(dāng)孔底形成小環(huán)狀凝集，但外周邊緣光滑、完整時(shí)判斷可疑。顆粒在孔底聚集成紐扣狀且邊緣光滑，則判斷為陰性結(jié)果。試驗(yàn)操作依說明書，在室溫條件下，用稀釋液將血清樣本分別在u形板上稀釋，并加入致敏顆粒或未致敏顆粒，靜置2h，觀察結(jié)果，加致敏粒子孔大于或等于1：80為陽(yáng)性。

1.3 診斷方法

參照衛(wèi)生部2007年頒布的中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS273-2007《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》做為胎傳梅毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，實(shí)驗(yàn)室檢查非特異性類脂質(zhì)抗原試驗(yàn)與特異性密螺旋體抗原試驗(yàn)呈雙陽(yáng)是診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。endprint

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用，檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母親與新生兒梅毒螺旋體抗體檢測(cè)方法比較

所有梅毒產(chǎn)婦標(biāo)本三種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。新生兒TRUST檢測(cè)陽(yáng)性檢出率為51.2%，與母親的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=54.24，P<0.05）。新生兒TP-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性83例，陽(yáng)性檢出率達(dá)98.8%，與母親對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x²=1.01，P>0.05）。TPPA檢出新生兒陽(yáng)性84例，陽(yáng)性檢出率為100%，與母親對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

3 討論

梅毒螺旋體抗原成分分為梅毒螺旋體膜蛋白抗原和內(nèi)鞭毛蛋白抗原兩種，膜蛋白抗原包括心磷脂抗原和類脂抗原，內(nèi)鞭毛蛋白抗原包括特異性不耐熱抗原與特異性耐熱的多糖抗原（多糖-RNA復(fù)合物），可刺激機(jī)體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素和抗梅毒螺旋體抗原特異性抗體。根據(jù)檢測(cè)所用抗原的不同，檢測(cè)患者血清中非密螺旋體抗原血清試驗(yàn)和梅毒螺旋體抗原血清實(shí)驗(yàn)是臨床診斷梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢查兩種方法。TRUST作為非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)的代表，其靈敏度與特異性均低于以FTA-ABS、TPPA為代表的梅毒螺旋體特異性抗原檢測(cè)，但其在對(duì)梅毒感染的初篩以及觀察療效、隨訪和復(fù)發(fā)的輔助診斷中有重要價(jià)值。

新生兒先天性梅毒又稱胎傳梅毒，梅毒螺旋體經(jīng)由母體胎盤傳給胎兒，可能由在孕前或在妊娠期間感染梅毒，且未經(jīng)治愈的產(chǎn)婦傳播。梅毒產(chǎn)婦垂直傳播的概率接近100%。梅毒孕婦及隨之而來的先天性梅毒，現(xiàn)在主要出現(xiàn)在許多發(fā)展中國(guó)家。先天性梅毒主要是缺乏產(chǎn)前護(hù)理（antenatal care，ANC）和性傳播感染控制的后果。根據(jù)國(guó)外研究調(diào)查，在瑞士，相對(duì)于國(guó)際準(zhǔn)則，在妊娠期間梅毒篩查一般不建議使用，但因此在瑞士人口中2006年到2009年間感染梅毒的育齡婦女病例大幅增加。在匈牙利，在懷孕的前三個(gè)月，在產(chǎn)前檢查中梅毒的篩選檢查是強(qiáng)制性的，以防止梅毒的發(fā)展。在我國(guó)，先天性梅毒已對(duì)新生兒健康造成了嚴(yán)重影響，為保障優(yōu)生優(yōu)育，保障我國(guó)人口出生質(zhì)量與健康，及早的診斷、干預(yù)和治療是基礎(chǔ)。作為臨床實(shí)驗(yàn)診斷科室，應(yīng)當(dāng)聯(lián)系應(yīng)用不同的檢測(cè)方法，使檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏度與特異性相結(jié)合，因此正確地選擇與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用檢測(cè)方法對(duì)新生兒梅毒診斷的初篩具有重要意義。

TRUST試驗(yàn)主要用于Ⅰ、Ⅱ期梅毒的定性篩查，這種非梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)的缺陷主要包括在初級(jí)和晚期梅毒檢測(cè)靈敏度的低下，和可能存在的前帶反應(yīng)或假陽(yáng)性結(jié)果。前帶反應(yīng)一般在Ⅱ期梅毒患者中有1%～2%的發(fā)生率，是由于當(dāng)抗體過量時(shí)阻礙了正?？贵w-抗原反應(yīng)。有研究表明TRUST亦可做為半定量試驗(yàn)觀察，其滴度的變化可以很好的反映梅毒患者的預(yù)后，對(duì)梅毒患者的療效觀察有重要意義。梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)，例如ELISA或者TPPA較TRUST要更加昂貴，用于在一定程度上會(huì)加重患者的負(fù)擔(dān)，但是可以反映患者是否曾經(jīng)感染和其治療情況。因此美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC）與Binnicker等建議使用反向梅毒篩查算法，即自動(dòng)化梅毒螺旋體抗體檢測(cè)（如ELISA）。

人體感染梅毒螺旋體后，IgM抗體產(chǎn)生先于IgG與IgA抗體，因此IgM抗體檢測(cè)可應(yīng)用于梅毒的早期診斷。先天性梅毒新生兒出生早期常缺乏臨床癥狀和體征，同時(shí)難以獲取暗視野顯微鏡檢查所需標(biāo)本。由于小分子的IgG可通過孕婦的胎盤屏障，而較大的IgM一般不能夠通過胎盤，無(wú)法進(jìn)入胎兒的血液循環(huán)中，所以只有在新生兒血清中檢測(cè)到特異性IgM抗體時(shí)，說明胎兒受到了宮內(nèi)感染，自身產(chǎn)生了梅毒特異性抗體。所以，新生兒梅毒的檢測(cè)，采用免疫印跡法（Western-blot法）檢測(cè)抗梅毒螺旋體IgM抗體，可獲得高特異性與高敏感性的結(jié)果，是判斷結(jié)果準(zhǔn)確的方法，但該方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，臨床上常不使用。

本研究中，我們可以看到，TRUST試驗(yàn)由于是非特異性心磷脂抗體檢查，相對(duì)炅敏度與特異性較低（51.2%與92.0%），且新生兒血清TRUST滴度與其母親的血清滴度相比較，新生兒的滴度普遍比母親要低，但若新生兒的滴度高于母親的4倍，應(yīng)當(dāng)高度懷疑先天性梅毒的存在。TP-ELISA試驗(yàn)具有較高的靈敏度與特異性（98.8%與98.0%），并且由于其酶放大效應(yīng)，可使ELISA的敏感性甚至高于TPPA法，本次研究由于樣本量較小，并沒有在結(jié)果中體現(xiàn)出來，而且ELISA易于自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡(jiǎn)單快捷，但可因抗體滴度過高而出現(xiàn)假陰性，因此臨床高度懷疑是新生兒梅毒時(shí)需用TPPA作確診試驗(yàn)。TPPA也具有很高的靈敏度與特異性（100%與100%），但由于其操作繁瑣復(fù)雜，可應(yīng)用于新生兒梅毒的確診。一般在初篩試驗(yàn)中，應(yīng)盡量提高其靈敏度，因此初篩建議使用TP-ELISA作為新生兒梅毒螺旋體抗體初篩試驗(yàn)，而不是TRUST試驗(yàn)。

綜上所述，TRUST適用于對(duì)梅毒感染治療效果進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)（ELISA、TPPA等）在待測(cè)血清除去了交叉抗體，提高了特異性，因此可作為確證試驗(yàn)，對(duì)潛伏期和晚期梅毒敏感性更高。不能單憑梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性作為診斷新生兒梅毒的絕對(duì)依據(jù)，它只提示標(biāo)本中存在類脂抗體或TP抗體，同時(shí)也不能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室檢查的陰形結(jié)果排除梅毒螺旋體的感染，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。

（收稿日期：2015-09-18）endprint