褚雪蓮　嚴(yán)麗英

[摘要]目的：探討梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）抗體在診斷新生兒梅毒中的應(yīng)用。方法：分別用甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）、TP-ELISA和密螺旋體顆粒凝集實驗（TPPA）法對84例確診新生兒梅毒患者與100例健康新生兒血清進行檢測。結(jié)果：三種檢測梅毒螺旋體抗體方法的靈敏度分別為51.2%、98.8%和100%，相對而言，TRUST法不適合作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗。結(jié)論：TP-ELISA法靈敏度與特異性相對較高，操作簡便易行，建議作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗；TPPA法由于操作繁瑣復(fù)雜，可結(jié)合臨床作為新生兒梅毒的確診試驗。

[關(guān)鍵詞]梅毒螺旋體抗體；新生兒梅毒；甲苯胺紅不加熱血清試驗；雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗；密螺旋體顆粒凝集實驗

[中圖分類號]R759.1 [文獻標(biāo)志碼]A

蒼白密螺旋體（treponema pallidum，TP）蒼白亞種，又稱梅毒螺旋體，是性傳播疾病梅毒的病原體。人類是梅毒螺旋體的唯一傳染源，性接觸直接傳染是最主要的傳播途徑，但患梅毒的孕婦可經(jīng)胎盤感染胎兒，多發(fā)生于妊娠4個月之后。通過胎盤梅毒螺旋體進入胎兒血流，經(jīng)血流擴散至全身，發(fā)生全身性感染，并在肝、脾、腎上腺等處大量生長繁殖，致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎的發(fā)生。而晚期感染成活的胎兒患有先天性梅毒（congenitalsyphilis，CS），常出現(xiàn)特殊體征如馬鞍鼻、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾、鋸齒形牙等。妊娠期梅毒常無明顯癥狀，為潛伏梅毒，而新生兒先天性梅毒易誤診漏診，使新生兒身體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。為了控制與避免梅毒螺旋體感染對新生兒造成巨大危害，控制先天性梅毒的發(fā)病率，規(guī)范、嚴(yán)格的產(chǎn)前梅毒篩查和先天性梅毒的早期診斷則顯得尤為重要。臨床癥狀和梅毒血清學(xué)檢測是目前臨床上對新生兒梅毒進行診斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。新生兒先天梅毒有多種臨床表現(xiàn)，癥狀體征缺乏特異性，并可造成多臟器累及。另外，發(fā)生漏診或者誤診，往往是由于父母不知情，或者故意隱瞞梅毒病史。梅毒螺旋體侵入人體后刺激人體產(chǎn)生兩類抗體，分別為宿主對螺旋體表面的脂質(zhì)做出應(yīng)答產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原抗體，與B細(xì)胞產(chǎn)生的IgM、IgG兩種特異性梅毒螺旋體抗體。梅毒血清學(xué)檢測根據(jù)使用抗原不同，分非特異性類脂質(zhì)抗原檢測與特異性密螺旋體抗原檢測兩大類，非特異性脂質(zhì)抗原檢測主要用于對梅毒的初步篩查，包括不加熱血清反應(yīng)素（USR）、快速血漿反應(yīng)素（RPR）及甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等；特異性密螺旋體抗原檢測使用的抗原是梅毒螺旋體的特異成分，主要包括熒光密螺旋體抗體吸收（FTA-ABS）、密螺旋體顆粒凝集實驗（TPPA）和膠體金法，這些方法常用于確診梅毒感染。由于母體IgM抗體不能通過胎盤，而胎兒B細(xì)胞只能產(chǎn)生IgM，出生3個月后才能合成IgG，故TP-IgM抗體檢測是新生兒先天性梅毒早期診斷最理想的方法。本研究對比討論了不同梅毒螺旋體抗體檢測方法在診斷新生兒梅毒中的特點與臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院新生兒科2006年4月至2014年5月確診梅毒的新生兒84例及新生兒母親84例作為研究對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)實驗室、病理學(xué)檢查確診為梅毒患者，符合《2015美國疾病控制中心性傳播疾?。范荆┲委熤改稀罚唬?）患者可出現(xiàn)硬下疳、多形性皮損等臨床表現(xiàn)：（3）患者簽署知情同意書，自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、肝、腎等其他器官嚴(yán)重器質(zhì)性病變患者：（2）意識不清及精神疾病患者。其中確診為梅毒新生兒年齡1h～14d；男44例，女40例。同時選擇我院健康新生兒100例作為對照?；純耗挲g為1h～6d。均采集空腹靜脈血（無溶血、脂血）2 3mL，離心分離血清-20℃保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 TRUST試劑盒（上海榮盛生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：140123），TP-ELISA試劑盒（廈門英科新創(chuàng)科技有限公司，生產(chǎn)批號：140319），TPPA試劑（日本富士瑞必歐株式會社珠海麗珠有限公司，生產(chǎn)批號：VN40628）。

1.2.2 TRUST試驗 該試驗以包被有心磷脂的膽固醇做為載體，與血清中的非特異性抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成膠體微粒。血清中的抗體，與混懸于甲苯膠紅溶液中的抗原微粒反映出現(xiàn)肉眼可見的粉紅凝集塊即判斷為陽性。按試劑盒說明書要求，按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32對待測血清進行倍比稀釋，觀察呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度報告梅毒血清TRUST滴度。

1.2.3 TP-ELISA法檢測 該檢測方法使用超聲波擊碎的Nichol株為抗原，用雙抗原夾心ELISA法，來檢測TP抗體是否存在于待測血清中。將高純度TP特異抗原包被于微孔反應(yīng)板中，加入標(biāo)本血清和酶標(biāo)的高純度TP抗原，形成TP抗原-TP抗體一酶標(biāo)TP抗原夾心復(fù)合物。利用酶底物/色原液（過氧化脲/TMB）產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色強度與TP抗體水平成正比。試驗操作依據(jù)試劑說明書要求，然后酶標(biāo)儀波長450nm，空白孔調(diào)零，測定OD值，OD值/cutoff值≥1判定為陽性，OD值/cutoff值<1則判定為陰性，臨界值=陰性對照OD均值×2.8。

1.2.4 TPPA法檢測 該試驗是用明膠顆粒包被梅毒螺旋體Nichols株的精致菌體成分制成的致敏顆粒來檢測TP抗體，當(dāng)樣本中的TP抗體與該顆粒結(jié)合時可發(fā)生凝集，不管是均一顆粒凝集或是較大的環(huán)狀凝集均可判斷為陽性。當(dāng)孔底形成小環(huán)狀凝集，但外周邊緣光滑、完整時判斷可疑。顆粒在孔底聚集成紐扣狀且邊緣光滑，則判斷為陰性結(jié)果。試驗操作依說明書，在室溫條件下，用稀釋液將血清樣本分別在u形板上稀釋，并加入致敏顆?；蛭粗旅纛w粒，靜置2h，觀察結(jié)果，加致敏粒子孔大于或等于1：80為陽性。

1.3 診斷方法

參照衛(wèi)生部2007年頒布的中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS273-2007《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》做為胎傳梅毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，實驗室檢查非特異性類脂質(zhì)抗原試驗與特異性密螺旋體抗原試驗呈雙陽是診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。endprint

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，計數(shù)資料用，檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母親與新生兒梅毒螺旋體抗體檢測方法比較

所有梅毒產(chǎn)婦標(biāo)本三種檢測結(jié)果均為陽性。新生兒TRUST檢測陽性檢出率為51.2%，與母親的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x²=54.24，P<0.05）。新生兒TP-ELISA檢測陽性83例，陽性檢出率達98.8%，與母親對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x²=1.01，P>0.05）。TPPA檢出新生兒陽性84例，陽性檢出率為100%，與母親對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3 討論

梅毒螺旋體抗原成分分為梅毒螺旋體膜蛋白抗原和內(nèi)鞭毛蛋白抗原兩種，膜蛋白抗原包括心磷脂抗原和類脂抗原，內(nèi)鞭毛蛋白抗原包括特異性不耐熱抗原與特異性耐熱的多糖抗原（多糖-RNA復(fù)合物），可刺激機體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素和抗梅毒螺旋體抗原特異性抗體。根據(jù)檢測所用抗原的不同，檢測患者血清中非密螺旋體抗原血清試驗和梅毒螺旋體抗原血清實驗是臨床診斷梅毒的實驗室檢查兩種方法。TRUST作為非梅毒螺旋體抗原試驗的代表，其靈敏度與特異性均低于以FTA-ABS、TPPA為代表的梅毒螺旋體特異性抗原檢測，但其在對梅毒感染的初篩以及觀察療效、隨訪和復(fù)發(fā)的輔助診斷中有重要價值。

新生兒先天性梅毒又稱胎傳梅毒，梅毒螺旋體經(jīng)由母體胎盤傳給胎兒，可能由在孕前或在妊娠期間感染梅毒，且未經(jīng)治愈的產(chǎn)婦傳播。梅毒產(chǎn)婦垂直傳播的概率接近100%。梅毒孕婦及隨之而來的先天性梅毒，現(xiàn)在主要出現(xiàn)在許多發(fā)展中國家。先天性梅毒主要是缺乏產(chǎn)前護理（antenatal care，ANC）和性傳播感染控制的后果。根據(jù)國外研究調(diào)查，在瑞士，相對于國際準(zhǔn)則，在妊娠期間梅毒篩查一般不建議使用，但因此在瑞士人口中2006年到2009年間感染梅毒的育齡婦女病例大幅增加。在匈牙利，在懷孕的前三個月，在產(chǎn)前檢查中梅毒的篩選檢查是強制性的，以防止梅毒的發(fā)展。在我國，先天性梅毒已對新生兒健康造成了嚴(yán)重影響，為保障優(yōu)生優(yōu)育，保障我國人口出生質(zhì)量與健康，及早的診斷、干預(yù)和治療是基礎(chǔ)。作為臨床實驗診斷科室，應(yīng)當(dāng)聯(lián)系應(yīng)用不同的檢測方法，使檢驗結(jié)果的靈敏度與特異性相結(jié)合，因此正確地選擇與評價實驗室現(xiàn)用檢測方法對新生兒梅毒診斷的初篩具有重要意義。

TRUST試驗主要用于Ⅰ、Ⅱ期梅毒的定性篩查，這種非梅毒螺旋體抗體試驗的缺陷主要包括在初級和晚期梅毒檢測靈敏度的低下，和可能存在的前帶反應(yīng)或假陽性結(jié)果。前帶反應(yīng)一般在Ⅱ期梅毒患者中有1%～2%的發(fā)生率，是由于當(dāng)抗體過量時阻礙了正?？贵w-抗原反應(yīng)。有研究表明TRUST亦可做為半定量試驗觀察，其滴度的變化可以很好的反映梅毒患者的預(yù)后，對梅毒患者的療效觀察有重要意義。梅毒螺旋體特異性抗體檢測，例如ELISA或者TPPA較TRUST要更加昂貴，用于在一定程度上會加重患者的負(fù)擔(dān)，但是可以反映患者是否曾經(jīng)感染和其治療情況。因此美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）與Binnicker等建議使用反向梅毒篩查算法，即自動化梅毒螺旋體抗體檢測（如ELISA）。

人體感染梅毒螺旋體后，IgM抗體產(chǎn)生先于IgG與IgA抗體，因此IgM抗體檢測可應(yīng)用于梅毒的早期診斷。先天性梅毒新生兒出生早期常缺乏臨床癥狀和體征，同時難以獲取暗視野顯微鏡檢查所需標(biāo)本。由于小分子的IgG可通過孕婦的胎盤屏障，而較大的IgM一般不能夠通過胎盤，無法進入胎兒的血液循環(huán)中，所以只有在新生兒血清中檢測到特異性IgM抗體時，說明胎兒受到了宮內(nèi)感染，自身產(chǎn)生了梅毒特異性抗體。所以，新生兒梅毒的檢測，采用免疫印跡法（Western-blot法）檢測抗梅毒螺旋體IgM抗體，可獲得高特異性與高敏感性的結(jié)果，是判斷結(jié)果準(zhǔn)確的方法，但該方法操作復(fù)雜費時，臨床上常不使用。

本研究中，我們可以看到，TRUST試驗由于是非特異性心磷脂抗體檢查，相對炅敏度與特異性較低（51.2%與92.0%），且新生兒血清TRUST滴度與其母親的血清滴度相比較，新生兒的滴度普遍比母親要低，但若新生兒的滴度高于母親的4倍，應(yīng)當(dāng)高度懷疑先天性梅毒的存在。TP-ELISA試驗具有較高的靈敏度與特異性（98.8%與98.0%），并且由于其酶放大效應(yīng)，可使ELISA的敏感性甚至高于TPPA法，本次研究由于樣本量較小，并沒有在結(jié)果中體現(xiàn)出來，而且ELISA易于自動化、標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡單快捷，但可因抗體滴度過高而出現(xiàn)假陰性，因此臨床高度懷疑是新生兒梅毒時需用TPPA作確診試驗。TPPA也具有很高的靈敏度與特異性（100%與100%），但由于其操作繁瑣復(fù)雜，可應(yīng)用于新生兒梅毒的確診。一般在初篩試驗中，應(yīng)盡量提高其靈敏度，因此初篩建議使用TP-ELISA作為新生兒梅毒螺旋體抗體初篩試驗，而不是TRUST試驗。

綜上所述，TRUST適用于對梅毒感染治療效果進行動態(tài)監(jiān)測，梅毒螺旋體特異性抗體檢測（ELISA、TPPA等）在待測血清除去了交叉抗體，提高了特異性，因此可作為確證試驗，對潛伏期和晚期梅毒敏感性更高。不能單憑梅毒的血清學(xué)試驗陽性作為診斷新生兒梅毒的絕對依據(jù)，它只提示標(biāo)本中存在類脂抗體或TP抗體，同時也不能因為實驗室檢查的陰形結(jié)果排除梅毒螺旋體的感染，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。

（收稿日期：2015-09-18）endprint