龔慧珍　王悅　潘偉文　吳線玲　季金英　謝軍花　包甘芬

[摘要]目的：研究探討宮頸組織中P-Akt的表達(dá)情況，并分析其與HPV感染之間的關(guān)系。方法：選取龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院接受治療并經(jīng)病理診斷確診為宮頸癌的患者35例作為研究對(duì)象，確診后送往上級(jí)醫(yī)院行手術(shù)治療。手術(shù)前均行HPV-DNA檢測(cè)，手術(shù)后上級(jí)醫(yī)院采用免疫組化方法對(duì)其病變組織中的P-Akt表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變患者和慢性宮頸炎患者各35例作為對(duì)照，分別比較三組患者的P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率。并對(duì)宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中HPV感染陽(yáng)性與P-Akt表達(dá)陽(yáng)性之間的關(guān)系進(jìn)行比較。結(jié)果：宮頸癌患者、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者、慢性宮頸炎患者的P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率分別為97.1%、80.0%和20.0%，比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中，HPV感染陽(yáng)性患者的P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率（95.2%）也顯著高于HPV感染陰性的患者（28.6%），比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論：P-Akt陽(yáng)性表達(dá)與宮頸病變的程度、HPV感染之間都存在顯著相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌組織；P-Akt表達(dá)；HPV感染

[中圖分類號(hào)]R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

宮頸癌是婦科臨床常見(jiàn)疾病，位居全球女性癌癥發(fā)病率之首，且有逐年上升、年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的身體健康和生命安全。本文就龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院收治的宮頸癌患者作為研究對(duì)象，探討Akt的活化形式磷酸化蛋白激酶B（P-Akt）在腫瘤中的表達(dá)情況以及其與HPV病毒感染之間的相互關(guān)系。具體報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院2014年1月至2015年10月診斷為宮頸癌患者35例作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)手術(shù)病理診斷證實(shí)。參與本研究的患者均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者在取材前均未接受任何治療：年齡在18歲以上：且標(biāo)本來(lái)源于手術(shù)后新鮮宮頸組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重肝腎功能障礙的患者；合并免疫系統(tǒng)疾病的患者；有精神疾病病史的患者：合并血液系統(tǒng)疾病的患者。

宮頸癌患者的年齡在24歲到57歲之間，平均年齡為（39.6+3.3）歲。

同時(shí)，選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變患者和慢性宮頸炎患者各35例作為對(duì)照，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的年齡在22～56歲之間，平均（40.1±2.1）歲：慢性宮頸炎患者的年齡在21歲到58歲之間，平均（40.9±2.7）歲。

所有患者均送往上級(jí)醫(yī)院接受治療，在治療前于我院接受過(guò)HPV-DNA檢測(cè)，并在治療后于上級(jí)醫(yī)院行病變組織P-Akt表達(dá)檢測(cè)，檢測(cè)資料均完整準(zhǔn)確。

1.2 方法

HPV-DNA檢測(cè)：采集患者病變組織，使用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照亞能（深圳）生物科技有限公司生產(chǎn)的HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)YZB/國(guó)5128-2013）的操作要求，對(duì)HPV-DNA進(jìn)行提取后，依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交、顯色，并觀察檢測(cè)結(jié)果。以相應(yīng)片段長(zhǎng)度處出現(xiàn)條帶的情況為HPV感染陽(yáng)性。

病變組織P-Akt表達(dá)檢測(cè)：行手術(shù)治療后于上級(jí)醫(yī)院行病變組織P-Akt表達(dá)檢測(cè)。采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。將獲得的宮頸病變組織標(biāo)本浸泡在10%的甲醛溶液中進(jìn)行固定后，依次經(jīng)補(bǔ)充固定、脫水透明、浸蠟、包埋等步驟對(duì)組織進(jìn)行處理，制作石蠟塊。將石蠟塊切片，厚度為4μm，其中一張做常規(guī)HE染色，并在光鏡下進(jìn)行觀察和診斷；另一張石蠟切片常規(guī)脫蠟、蒸餾水沖洗、PBS浸泡、高壓修復(fù)（檸檬酸鹽抗原修復(fù)液）、PBS多次沖洗、內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑室溫下孵育、PBS沖洗、羊非免疫血清室溫孵育、除血清后依次加一抗（P-Akt1/2/3多克隆抗體）、二抗，經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗后，向其中加入鏈霉菌抗生物索蛋白-過(guò)氧化酶，孵育、DAB染色、沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封固后再光鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（200個(gè)細(xì)胞），按照細(xì)胞的染色程度進(jìn)行積分，以細(xì)胞無(wú)色記為O分，以細(xì)胞呈淡黃色記為1分，以細(xì)胞為棕黃色記為2分，以細(xì)胞為棕褐色記為3分。將光鏡下細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核有十分明顯的棕黃色細(xì)顆粒判斷為P-Akt表達(dá)陽(yáng)性，并以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在5%以下記0分，在5%～25%之間記1分，在26%～50%之間記2分，在50%以上記為3分。計(jì)算其染色強(qiáng)度得分和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分之間的乘積，并以積分≥3分P-Akt表達(dá)陽(yáng)性，積分在0～2分之間為表達(dá)陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中計(jì)量資料對(duì)比采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料對(duì)比采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比較宮頸癌患者、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者、慢性宮頸炎患者的P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率，可見(jiàn)其分別為97.1%、80.0%和20.0%，三組患者之間的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。見(jiàn)表1。

宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者共計(jì)70例，其中，HPV檢測(cè)陽(yáng)性的患者63例，HPV感染陽(yáng)性率為90.0%，其中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)患者60例，占95.2%；7例HPV檢測(cè)陰性的患者中，P-Akt陽(yáng)性者為2例（28.6%），HPV感染陽(yáng)性患者的P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率也顯著高于HPV感染陰性的患者，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

3 討論

宮頸癌具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，對(duì)宮頸癌患者的早期診斷和及時(shí)治療對(duì)于女性患者具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)95%的宮頸癌患者均有人乳頭瘤病毒（HPV）感染的情況，而并非患者發(fā)生HPV病毒后就一定會(huì)發(fā)展成為宮頸癌，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，發(fā)生HPV病毒感染的患者中，僅有一成左右在持續(xù)感染的情況下最終發(fā)展成為宮頸高危病變或者浸潤(rùn)性宮頸癌，因而HPV病毒感染誘發(fā)宮頸癌的機(jī)制也并不十分明確。另一方面，Akt因其在腫瘤組織中的高表達(dá)情況已被定義為癌基因，作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其位于磷脂酰肌醇-3-激酶（P13K）/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐部位，而磷脂酰肌醇3激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是可以參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化調(diào)節(jié)等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞中廣泛存在，大部分的惡性腫瘤（如宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌等）都有P13K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活的情況，在這種情況下，腫瘤細(xì)胞受到刺激，發(fā)生惡性增殖、形成血管，并使得腫瘤細(xì)胞的侵襲或者轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。在正常的靜止細(xì)胞中，Akt/PKB一般處于組織細(xì)胞的胞漿中，而漿膜屬于活化部位，當(dāng)其受到細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素等的刺激作用后，Akt催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)位點(diǎn)相繼磷酸化，進(jìn)而活化，P-Akt就是Akt的活化形式，發(fā)生活化之后，其可以向胞液和胞核轉(zhuǎn)位，并起到揮調(diào)控作用。

本文分別比較了宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、慢性宮頸炎三種不同宮頸病變患者的P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)隨著病變程度越來(lái)越嚴(yán)重，P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率也越高，宮頸癌患者的P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)到97.1%，提示其與宮頸病變之間呈顯著正相關(guān)，而對(duì)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的HPV感染陽(yáng)性與P-Akt表達(dá)陽(yáng)性之間的關(guān)系進(jìn)行比較，也可見(jiàn)HPV感染陽(yáng)性患者的P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率（90.0%）顯著高于HPV感染陰性的患者（28.6%），二者也呈正相關(guān)，這與杜趁香等的研究結(jié)果一致，其還對(duì)宮頸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，P-Akt表達(dá)陽(yáng)性率可達(dá)100.0%。

有國(guó)外研究認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒HPV16的E5可以對(duì)P13K/Akt通路進(jìn)行激活，同時(shí)其產(chǎn)生的E6蛋白能夠與宿主細(xì)胞的抑癌基因P53結(jié)合并導(dǎo)致其降解，引起后者阻斷DNA異常細(xì)胞周期性復(fù)制的功能受損，并導(dǎo)致細(xì)胞永生化誘發(fā)癌變；其產(chǎn)生的E7蛋白有能夠與腫瘤抑制蛋白R(shí)b（控制細(xì)胞周期起始相關(guān)蛋白）相互作用，引起細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致永生化的發(fā)生。結(jié)合本文及相關(guān)國(guó)內(nèi)外研究的結(jié)果，均可以推測(cè)宮頸癌的發(fā)生，可能與P-Akt的激活有關(guān)，據(jù)此可以為宮頸癌的診斷治療提供新的研究方向。

（收稿日期：2015-05-06）endprint