林　靜，李美瓊，農(nóng)林琳（.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西桂林5400；.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，廣西桂林5400）

·論著·

胸腔積液細(xì)胞塊聯(lián)合免疫組化在肺腺癌與間皮細(xì)胞增生鑒別診斷中的應(yīng)用*

林靜1，李美瓊1，農(nóng)林琳2（1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西桂林541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，廣西桂林541001）

目的探討細(xì)胞塊聯(lián)合免疫組化方法在鑒別診斷腺癌性胸腔積液和間皮細(xì)胞中的作用。方法應(yīng)用涂片、細(xì)胞塊、免疫組化方法對80例胸腔積液進(jìn)行良惡性診斷。結(jié)果E-cadherin、TTF-1、CK7在肺腺癌中100%陽性或灶狀陽性，Vim及CR陰性?！巴科睓z測80例樣本中腺癌33例，陰性24例，不能明確診斷23例?！巴科?細(xì)胞塊+免疫組化“檢測80例樣本中腺癌48例，陰性31例，不能明確診斷1例。“涂片”與“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”在診斷腺癌性胸腔積液的靈敏度上比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.63，P＜0.05）。在診斷陰性胸腔積液的靈敏度上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.24，P＞0.05）。80例樣本中，通過“涂片”方法有23例不能明確診斷，通過“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”方法有1例不能明確診斷，二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.62，P＜0.01）。結(jié)論采用“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”聯(lián)合檢測能夠提高胸腔積液中腺癌診斷的靈敏度。

胸腔積液；染色與標(biāo)記；免疫組織化學(xué)；腺癌；增生；上皮細(xì)胞

胸腔積液是臨床中最為常見的一種體征，炎癥、肺腺癌是引起積液的2個常見原因。積液性質(zhì)的診斷在大多數(shù)基層單位主要通過涂片進(jìn)行，但是由于常規(guī)涂片法存在涂片厚，細(xì)胞重疊，結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞量少、陽性檢出率低等缺點(diǎn)，使得診斷的敏感性僅為50%～78%［1］，特別是對細(xì)胞形態(tài)不典型的間皮細(xì)胞、癌細(xì)胞的鑒別僅用直接離心涂片法時常難以勝任。文獻(xiàn)報道有高達(dá)12%的病例會遇到間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞難以鑒別的狀況［2］。這種診斷的不明確甚至可以延誤治療。本研究通過采用細(xì)胞塊技術(shù)［3］及相關(guān)免疫組化指標(biāo)選擇，對80例胸腔積液樣本進(jìn)行回顧性分析總結(jié)，旨在尋找一種高效、經(jīng)濟(jì)、適合在基層醫(yī)院推廣的鑒別良惡性胸腔積液的方法。

1　資料與方法

1.1一般資料標(biāo)本選取2010～2012年80例桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者的胸腔積液，均以胸腔積液為主要癥狀入院。其中36例胸腔積液引流后發(fā)現(xiàn)肺部或胸腔占位，19例由于胸腔積液多，無法判斷是否具有占位，25例胸腔積液引流后未發(fā)現(xiàn)明確占位。

1.2方法

1.2.1涂片及細(xì)胞塊制作胸腔積液均在120 min內(nèi)采集、送檢、處理。送檢積液均沉淀30 min，棄上清，留取底部液體沉渣50 mL，用一次性離心管分管置于低速離心機(jī)中2 000轉(zhuǎn)/分，離心5 min，棄上清，混勻，吸取少量沉淀采用涂抹法涂片2張，立即放入95%乙醇中固定30 min后采用HE染色封片。同時，其余沉淀物再次相同條件離心后，將試管上端剪去，僅留取帶有沉渣的試管底部，一同放入包埋盒內(nèi)，先用95%乙醇固定2 h，再轉(zhuǎn)入中性甲醛中固定，常規(guī)脫水包埋形成細(xì)胞塊。細(xì)胞塊連續(xù)切片，一張采用HE染色觀察形態(tài)，其余供做免疫組化染色。

1.2.2免疫組化染色研究選取如下免疫組化指標(biāo)E-cadherin、TTF-1、CK7、Vim、CR。鼠抗人單克隆抗體E-cadherin、TTF-1、CK7、Vim，多克隆抗體CR以及二抗試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，采用免疫組化二步法，采用各抗體已知陽性部位組織塊做陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3結(jié)果判斷E-cadherin陽性細(xì)胞為胞膜/胞漿著色，CK7、CR、Vim陽性細(xì)胞為胞漿著色，TTF-1陽性細(xì)胞為胞核著色。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1細(xì)胞塊制作效果評估理想的細(xì)胞塊其細(xì)胞聚集緊密成塊，可以連續(xù)切片、進(jìn)行各種染色而不脫片或是破碎，切片皺褶較少。鏡下觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，偶有局部細(xì)胞脫落情況但并不影響觀察診斷及計數(shù)。

2.2涂片結(jié)果結(jié)合涂片形態(tài)特點(diǎn)，80例樣本中腺癌33例，陰性24例，不能明確診斷23例。

2.3各種免疫組化指標(biāo)在胸腔積液細(xì)胞塊中的表達(dá)情況E-cadherin、TTF-1、CK7在涂片診斷腺癌的33例胸腔積液病例中，癌細(xì)胞100%陽性或灶狀陽性表達(dá)，Vim 及CR陰性。在涂片診斷陰性的24例胸腔積液病例中，E-cadherin、TTF-1、CK7陽性者1例，對應(yīng)Vim及CR陰性；E-cadherin、TTF-1、CK7陰性者23例，Vim陽性，CR灶狀陽性。涂片不能明確診斷的23例胸腔積液中，E-cadherin、TTF-1、CK7陽性者14例，對應(yīng)Vim及CR陰性；E-cadherin、TTF-1、CK7陰性者8例，Vim陽性，CR灶狀陽性；免疫組化結(jié)果不理想無法判斷者1例。根據(jù)免疫組化結(jié)果，80例胸腔積液中，腺癌性胸腔積液48例，良性胸腔積液31例，不能明確診斷1例。

表1　免疫組化結(jié)果（n）

2.4不同方法檢測胸腔積液靈敏度比較“涂片”檢測80例樣本中腺癌 33例，陰性 24例，不能明確診斷23例?！巴科?細(xì)胞塊+免疫組化“檢測80例樣本中腺癌48例，陰性31例，不能明確診斷1例?！巴科迸c“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”在診斷腺癌性胸腔積液的靈敏度方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.63，P＜0.05）。在診斷陰性胸腔積液的靈敏度方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 0.24，P＞0.05）。80例樣本中，通過“涂片”方法有23例不能明確診斷，通過“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”方法有1例不能明確診斷，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.62，P＜0.01）。

表2　不同方法診斷80例胸腔積液靈敏度的區(qū)別（n=80）

3　討　論

胸腔積液的良惡性判斷對于臨床的治療有明確的指導(dǎo)意義，提高胸腔積液的陽性檢出率一直是病理工作者所追求的。本研究發(fā)現(xiàn)80例樣本中，通過“涂片”方法有23例不能明確診斷，通過“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”方法僅有1例不能明確診斷，陽性檢出靈敏度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.62，P＜0.01），即采用聯(lián)合方法能夠診斷更多的病例。另外，涂片診斷腺癌組和涂片診斷陰性組中各有1例免疫表型與“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”診斷不符，提示光憑涂片的形態(tài)診斷可能存在偏差，通過增加細(xì)胞塊免疫組化的方法，可以提高診斷的準(zhǔn)確性。

常規(guī)的離心涂片技術(shù)，能較準(zhǔn)確診斷出典型病例，但實(shí)際工作中常受到細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)不典型的限制，診斷時常會出現(xiàn)困難［4-5］。細(xì)胞學(xué)免疫組化在很多單位未常規(guī)開展，究其可能的原因包括涂片標(biāo)本制片重復(fù)性差，面積大而耗費(fèi)試劑多、涂片薄厚不均影響染色，且因染色時脫片導(dǎo)致標(biāo)本丟失等原因使得操作較為困難。即使染色成功也常會出現(xiàn)背景深、非特異性著色、陽性不可靠等缺點(diǎn)。而細(xì)胞塊技術(shù)的應(yīng)用則可以很好地解決以上問題。免疫組化對于腫瘤的鑒別診斷、功能分類和指導(dǎo)臨床診斷與治療有重要意義［6］。用細(xì)胞塊做免疫組化染色，可連續(xù)切片，有利于多種抗體組合運(yùn)用或?qū)δ骋惶囟?xì)胞的比較觀察，陽性顆粒為棕黃色，定位準(zhǔn)確可靠、背景清晰、可重復(fù)性高，提高了疑難病例診斷的準(zhǔn)確率［7-8］。

本研究采用E-cadherin、TTF-1、CK7、Vim及CR免疫組化指標(biāo)對胸腔積液進(jìn)行輔助診斷。

E-cadherin是一類介導(dǎo)細(xì)胞間粘連作用的跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)［9］。TTF-1在成人Ⅱ型肺泡上皮中存在，常用于肺腺癌與間皮瘤的鑒別，且TTF-1陽性部位在細(xì)胞核，定位準(zhǔn)確，易于觀察。CK7在腺上皮中有較高的表達(dá)，聯(lián)合TTF-1、E-cadherin能夠較好的標(biāo)記肺腺癌細(xì)胞。Vim、CR在正常和腫瘤性間皮細(xì)胞表達(dá)［10］，E-cadherin、TTF-1、CK7在間皮細(xì)胞及其腫瘤中不表達(dá)，5種指標(biāo)聯(lián)合檢測，能夠較好地區(qū)別肺腺癌及反應(yīng)性間皮細(xì)胞。

胸腔積液采用“涂片+細(xì)胞塊+免疫組化”聯(lián)合檢查的方法，能夠有效提高診斷的陽性率和準(zhǔn)確性，方法簡單，易于操作，適合在廣大基層單位推廣。

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本刊編輯部

Application of pleural effusion cell block combined with immunohistochemistry in differentiation diagnosis of lung adenocarcinoma and mesothelial cell hyperplasia

Lin Jing1，Li Meiqiong1，Nong Linlin2（1.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China；2.Morphology the Experiment Center，Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China）

ObjectiveTo investigate the role of cell block combined with immunohistochemical method in the differential diagnosis of lung adenocarcinoma pleural effusion and mesothelial cell hyperplasia.MethodsThe benign and malignant diagnosis in 80 cases of pleural effusion was carried out by using the smear，cell block and immunohistochemical method.Results E-cadherin，TTF-1 and CK7 had 100%positive or focal positive in lung adenocarcinoma，vim and CR were negative.In the smear detection，there were 33 cases of adenocarcinoma among 80 samples，24 cases were negative，23 cases were undetermined diagnosis.In the smear+cell block+immunohistochemistry detection，there were 48 cases of adenocarcinoma among 80 samples，31 cases were negative and 1 case was undetermined diagnosis.The sensitivity for diagnosing adenocarcinoma pleural effusion had statistical difference between the smear and the smear+cell block+s immunohistochemistry（χ2=5.63，P＜0.05）.The sensitivity for diagnosing the negative pleural effusion had no statistical difference（χ2=0.24，P＞0.05）.Among 80 samples，23 cases could not be clearly diagnosed by the smear method，while 1case was not diagnosed by the mear+cellblock+immunhistochemistry method，the difference was statistically significant（χ2=21.62，P＜0.01）.ConclusionAdopting the smear+cell block+immunohistochemistry method can increase the sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma in pleural effusion.

Pleural effusion；Staining and labeling；Immunohistochemistry；Adenocarcinoma；Hyperplasia；Epithelial cells

·論著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.006

A

1009-5519（2016）03-0338-02

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題（Z2011183）。

林靜（1980-），碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事細(xì)胞病理學(xué)診斷及研究工作。

（2015-11-03）