楊俊卿， 孔凡娜， 李　超， 畢桂萁， 孫美娟， 趙海龍， 李　娜， 茅云翔

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 青島 266003；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266021)

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條斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析*

楊俊卿1， 孔凡娜1**， 李超1， 畢桂萁1， 孫美娟2， 趙海龍1， 李娜1， 茅云翔1

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 青島 266003；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266021)

本研究從條斑紫菜中克隆了一個水通道蛋白(Aquaporin，簡稱AQP)基因PyAQP，命名為PyAQP1 (登錄號為KT735045)。序列分析表明，PyAQP1基因cDNA全長為1 151bp，開放閱讀框(ORF)為1 002bp，編碼333個氨基酸，含有200bp的內(nèi)含子。氨基酸序列比對分析表明，PyAQP1具有水通道蛋白的保守結(jié)構(gòu)域NPA和6個跨膜區(qū)域。MEGA5.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹表明，該基因?qū)儆贕lps類。采用基因槍介導(dǎo)的洋蔥瞬時表達(dá)定位結(jié)果顯示，PyAQP1基因定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對PyAQP1基因在干旱、鹽度和溫度處理條件下在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。在干旱處理條件下，PyAQP1基因隨著失水率的增加，表達(dá)量逐漸降低，失水率達(dá)到80%后復(fù)水處理，隨著復(fù)水時間的延長，表達(dá)量增加。在山梨醇和鹽度脅迫處理下，PyAQP1基因的表達(dá)趨勢基本一致，隨著鹽度的增加，表達(dá)量降低。溫度處理條件下，在-8 ℃時，基因的表達(dá)量顯著增加，0 ℃時，基因的表達(dá)量略高于正常處理條件。當(dāng)溫度高于正常生長溫度時，基因的表達(dá)量隨著溫度的升高，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。本研究為深入了解條斑紫菜逆境適應(yīng)機(jī)制中水通道蛋白的作用奠定了基礎(chǔ)，同時為后續(xù)條斑紫菜抗逆品系的選育提供了理論指導(dǎo)。

條斑紫菜；水通道蛋白；亞細(xì)胞定位；Realtime-PCR；非生物脅迫

引用格式：楊俊卿， 孔凡娜， 李超， 等. 條斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 46(8): 79-86.

YANGJun-Qing,KONGFan-Na,LIChao,etal.CloningandexpressionanalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis [J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2016, 46(8): 79-86.

條斑紫菜(Pyropia yezoensis (Ueda)M.S.HwangetH.G.Choi)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Rhodophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紫菜屬(Pyropia)[1]，是中國北方沿岸常見的種類。條斑紫菜由于其重要的經(jīng)濟(jì)價值被大規(guī)模栽培，為長江以北的主要栽培藻類之一。在長期的進(jìn)化過程中，條斑紫菜形成了適應(yīng)潮間帶環(huán)境的抗逆基因和生理生化機(jī)制，被認(rèn)為是潮間帶藻類研究的模式物種，更是開展抗逆相關(guān)分子機(jī)理研究的理想材料[2-4]。自然條件下，條斑紫菜的葉狀體生活在海水中，能在0～10 ℃的低溫下正常生長，-20 ℃冷藏長達(dá)數(shù)月后，下海仍能復(fù)活并正常生長；能忍耐長達(dá)2～3d的缺水狀態(tài)，即使被太陽曬干后發(fā)脆，漲潮后仍能正常生活[5]。

干旱、鹽度與溫度對植物體產(chǎn)生脅迫作用，并導(dǎo)致一系列滲透脅迫、離子脅迫及刺激傷害。各種非生物脅迫都會造成植物體細(xì)胞的水分失衡，而水通道蛋白可以有效控制逆境環(huán)境下植物體內(nèi)以及細(xì)胞內(nèi)部水分的運(yùn)輸。水通道蛋白通過影響水分子、小分子物質(zhì)和部分重金屬在植物體內(nèi)的運(yùn)輸有效地提高植物的抗逆性[6]。

水通道蛋白，又稱水孔蛋白，相對分子質(zhì)量大約在24～34kD[7]。它廣泛存在于各種生物膜上，在組織和器官的發(fā)育進(jìn)程以及中性分子的跨膜運(yùn)輸?shù)冗^程中發(fā)揮著重要作用[8]。到目前為止，水通道蛋白已在古生菌、真細(xì)菌、真菌、動物和植物等幾乎所有的生物中均有發(fā)現(xiàn)[9]。在植物中MIP家族(常簡稱水孔蛋白)，包括7大類，其中常見的有以下4類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs,Plasmamembraneintrinsicproteins)，液泡膜內(nèi)在蛋白(TIPs,Tonoplastintrinsicproteins)，類Nod26 膜內(nèi)在蛋白 (NIPs,Nodulin26-likeintrinsicproteins)與小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(SIPs,Smallandbasicintrinsicproteins)[10]，另外3類分別是GlpF(Glycerolfacilitator) 膜 內(nèi) 在 蛋 白(存在于低等生物細(xì)菌、藻類與苔蘚類中)[11]，混合內(nèi)在蛋白(HIP)和未被分類的XIP內(nèi)在蛋白[12]。植物水通道蛋白已經(jīng)被證實(shí)在維持體內(nèi)水平衡和響應(yīng)鹽度、干旱脅迫有重要作用，此外，有些亞類除了運(yùn)輸水分子外，還能夠運(yùn)輸氨、硅、二氧化碳和硼等[10,13]。Marinela等人首次從萊茵衣藻中克隆了MIP基因(命名為CrMIP)，并對該基因進(jìn)行了進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該基因與其他物種的MIP同源性較低。通過酵母突變體功能互補(bǔ)實(shí)驗與同位素14C標(biāo)記甘油實(shí)驗，證明該基因能夠促進(jìn)細(xì)胞對甘油的攝取[14]。Anderberg等人從已經(jīng)測序完成的9種綠藻基因組中獲得了22條MIPs基因，將22條MIPs基因分為7亞類：MIPA、MIPB、MIPC、MIPD、MIPE、PIPs和GlpF-like。認(rèn)為MIPA到MIPE5類基因與其他物種中的差異較大，PIP、GlpF-like類與陸地植物中的PIP、GlpF-like類基因相似。推測陸地植物中的PIP、GlpF-like類基因與藻類中的PIP、GlpF-like具有相同的起源[15]。但是，目前關(guān)于水通道蛋白在海洋藻類中的功能研究較少，在紅藻中尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)的報道。因此本研究希望能夠為海洋藻類的逆境脅迫機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗材料為實(shí)驗室培養(yǎng)的條斑紫菜葉狀體RZ品系，該品系是通過單細(xì)胞酶解后培養(yǎng)所得。亞細(xì)胞定位所用洋蔥(Allium cepa)為“紫星”品種。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與干旱、鹽度、溫度脅迫處理以新鮮的條斑紫菜葉狀體RZ為材料，待葉狀體生長長度為10cm左右時，選取葉片完整光滑、色深有光澤且處于旺盛生長期的健康藻體于同一通氣瓶中馴化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：鹽度為33的過濾海水加PES[16]營養(yǎng)鹽，10 ℃，50μmolphotons·m-2·s1，12L∶12D，通氣處理。取其中少部分材料進(jìn)行DNA的提取，部分材料進(jìn)行干旱、鹽度和溫度的處理。不同的處理條件見表1(每個處理設(shè)置3個平行)。失水率計算公式為：失水率(%)=(鮮重-失水后藻體重)/(鮮重-干重)×100。將處理完的材料迅速收集置于液氮中保存。

1.2.2 條斑紫菜葉狀體總RNA的提取、cDNA的合成利用E.Z.N.A.totalRNAKitⅠ(OMEGA)試劑盒提取不同處理條件下RZ葉狀體的總RNA，經(jīng)DNaseⅠ消化后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，然后用NaNoDrop檢測濃度與質(zhì)量，將A260/A230=2.0～2.2,A260/A280=1.8～2.0的RNA放-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA的合成采用RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit。DNA的提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)。具體實(shí)驗步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.3 PyAQP1基因克隆與生物信息學(xué)分析根據(jù)實(shí)驗室已有條斑紫菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(IDPRJNA235353)，通過功能注釋結(jié)果，從中篩選出水通道蛋白Unigene基因。利用本地blast方法將篩選出的Unigene與條斑紫菜的EST數(shù)據(jù)庫、CDS數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，比對上后進(jìn)行拼接延伸。將拼接后的序列，在NCBI的ORFFinder上進(jìn)行預(yù)測。

表1　條斑紫菜不同的處理條件

注：a低山梨醇與高滲，產(chǎn)生的滲透壓是相同的;b高山梨醇與超高滲，產(chǎn)生的滲透壓是相同的。

Note:aTheosmoticpressureoflowsorbitolandhighpermeabilityissame;bTheosmoticpressureofhighsorbitolandultra-highpermeabilityissame.

根據(jù)上述拼接序列，利用primer5設(shè)計上、下游引物AQPF1、AQPR1 (見表2)，分別以cDNA和DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性45s，58 ℃退火1min，72 ℃延伸1min35s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa)連接后進(jìn)行亞克隆，藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落，經(jīng)PCR驗證后，將陽性重組質(zhì)粒送至Invitrogen公司測序。

利用NCBI的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)網(wǎng)站預(yù)測基因的開放閱讀框。DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，運(yùn)用在線的軟件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測PyAQP1基因編碼蛋白的等電點(diǎn)與分子量；Predictprotein中的PhD(http://www.predictprotein.org/submit-meta.html)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)；TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域；NetPhos軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)預(yù)測蛋白的磷酸化位點(diǎn)。PSORTⅡPrediction軟件(http://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測細(xì)胞中基因編碼蛋白的位置。采用MEGA6.0，以鄰位連接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000runs)，進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析。

表2　PCR擴(kuò)增所用引物及其序列

1.2.4 PyAQP1的亞細(xì)胞定位分析

1.2.4.1 瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建瞬時表達(dá)載體p35S:PyAQP1-GFP的構(gòu)建采用pBI121載體，利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHI將其雙酶切，將兩端帶有XbaⅠ和BamHI酶切位點(diǎn)的目的基因PyAQP1與線性化載體PBI121進(jìn)行連接。依據(jù)In-Fusion引物設(shè)計原則，設(shè)計PyAQP1F2、PyAQP1R2擴(kuò)增PyAQP1基因(見表2)。具體操作見clontech的說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗證。

1.2.4.2 基因槍介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位切取2cm×2cm的洋蔥內(nèi)表皮組織，將其放置在固體MS培養(yǎng)基上，28 ℃弱光下預(yù)培養(yǎng)4h待用。利用基因槍介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將PBI121-PyAQP1-GFP和空載體PBI121-GFP分別導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，各做3個重復(fù)。基因槍轉(zhuǎn)化步驟參照參考文獻(xiàn)[17]。將轟擊后的洋蔥表皮放入23 ℃暗培養(yǎng)16h后，放入0.6mol/L蔗糖溶液中，使其發(fā)生質(zhì)壁分離，然后用DAPI進(jìn)行染色處理，制備臨時裝片，通過尼康熒光顯微鏡(Eclipse80i,Nikon)分別在白光、綠光(450～490nm)和藍(lán)光(330～380nm)下觀察。

1.2.5 PyAQP1基因的qRT-PCR分析利用熒光定量PCR方法檢測PyAQP1基因在不同脅迫下(見表1)mRNA水平的表達(dá)差異。PCR反應(yīng)體系如下：單鏈cDNA模板1μL，上、下游引物各0.2μmol/L，2×SYBRGreenⅠReal-timePCRMasterMix(Roche)10μL，加水補(bǔ)足至20μL。擴(kuò)增所用引物為PyAQP1F5和PyAQP1R5，內(nèi)參基因選擇為eIF4A和Tubulin，引物分別為eIF4AF3、eIF4AR3和TubulinF4、TubulinR4。每對引物分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，以排除引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對基因的相對表達(dá)量造成影響的可能性。利用RocheLightCycler? 480II儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)、2個技術(shù)重復(fù)，相對表達(dá)量的計算利用2-△△ct法[18]。應(yīng)用Excel和SPSS19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-WayANOVA)和最小差異顯著法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示極顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜PyAQP1基因的克隆

將電子克隆所得序列，設(shè)計引物進(jìn)行PCR測序驗證，同時在NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網(wǎng)站對核苷酸序列進(jìn)行BLASTX分析，以確定ORF的正確性，獲得1 151bp堿基序列(GenBank注冊號：KT735045)，含1 002bp開放閱讀框，編碼333個氨基酸(見圖1)。根據(jù)PyAQP1基因的cDNA序列在閱讀框兩端設(shè)計引物在cDNA和DNA中進(jìn)行擴(kuò)增，所得序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列含有預(yù)期的開放閱讀框，基因組序列中含有一個200bp內(nèi)含子(見圖1)。

2.2 條斑紫菜PyAQP1基因蛋白結(jié)構(gòu)分析

Protparam軟件預(yù)測PyAQP1基因編碼蛋白分子量為34.597KD，等電點(diǎn)為6.43。利用Predictprotein中的PhD軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)顯示，PyAQP1由α螺旋(34.53%)、β折疊(10.51%)、無規(guī)則卷曲(54.95%)組成。TMHMM軟件預(yù)測該蛋白有6個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，跨膜區(qū)域的氨基酸位置為65～87、99～118、146～168、220～241、254～276、308～330(見圖2)。氨基酸序列分析表明該蛋白含有MIP(Majorintrinsicprotein)家族中典型的保守NPA結(jié)構(gòu)域，由Asn-Pro-Ala3個氨基酸組成的，它們直接參與水通道的形成(見圖2)。運(yùn)用NetPhos軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13個可能的磷酸化位點(diǎn)，其中8個位于絲氨酸(S)上，4個位于蘇氨酸(T)上，1個位于酪氨酸(Y)上(見圖1)，推測這些磷酸化修飾位點(diǎn)可能與PyAQP1基因蛋白通道的開啟與閉合有關(guān)。PSORTⅡPrediction分析顯示該基因編碼的蛋白位于質(zhì)膜上。

(星號為終止密碼子，加粗下劃線為磷酸化位點(diǎn)，內(nèi)含子位置用倒三角標(biāo)出。Stopcodonismarkedwithanasterisk,thebondwithunderlinespredictedphosphorylationsites,theblackarrowheadsmarkthelocationsofintrons.)

圖1PyAQP1基因DNA序列及氨基酸序列

Fig.1DNAsequenceandaminoacidsequenceofPyAQP1

利用MEGA6.0軟件，進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析(見圖3)。由圖中可見，Glps進(jìn)化樹主要分成2大支，萊茵衣藻的Glps和單針藻的Glps(XP013897215.1)聚為一小支，其余的包括假單胞桿菌屬的Glps、金色藻的Glps、紅藻門的Glps、小球藻屬的Glps和小立碗蘚的Glps聚為一大支。其中，PyAQP1與龍須菜的親緣關(guān)系最近聚為一小支，再與角叉菜的聚為一支，然后與單細(xì)胞紅藻、小球藻、小立碗蘚的Glps聚在一起。

2.3 PyAQP1基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析

利用基因槍介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將PBI121-PyAQP1-GFP和空載體PBI121-GFP分別導(dǎo)入新鮮的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號在細(xì)胞內(nèi)的分布，分析PyAQP1在洋蔥亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化融合表達(dá)載體PBI121-PyAQP1-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光僅在質(zhì)膜上表達(dá)。轉(zhuǎn)化空載體PBI121-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中，綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜上都有表達(dá)(見圖4)，表明PyAQP1基因編碼蛋白定位在質(zhì)膜上，這與亞細(xì)胞定位預(yù)測的位置是一致的。

2.4 PyAQP1基因干旱、鹽度、溫度脅迫響應(yīng)的qRT-PCR分析

為了探究PyAQP1基因在干露、鹽度與溫度等不同環(huán)境因子脅迫下的表達(dá)模式，采用熒光定量PCR方法檢測了PyAQP1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明(見圖5)，在失水脅迫下，當(dāng)失水率達(dá)到20%時基因相對表達(dá)量最大，達(dá)到對照組的9倍左右。隨著失水率的增加，基因表達(dá)量逐漸降低，當(dāng)失水率達(dá)到80%時，基因的相對表達(dá)量約為對照組的4倍。在失水處理的3個階段，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。復(fù)水處理是將失水率達(dá)到80%后將其放在正常培養(yǎng)海水中復(fù)水處理15、30min。隨著紫菜細(xì)胞逐漸的恢復(fù)到原來的狀態(tài)，基因的相對表達(dá)量逐漸上升。復(fù)水處理時，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

(星號表示2個保守的NPA；上劃線表示6個跨膜區(qū)域。TwoconservedNPAmotifsaremarkedwithasterisks;theoverlinesshowsixtransmembrancedomain.條斑紫菜P.yezoensis PyAQP1(KT735045)，假單胞桿菌Pseudomonas deceptionensisGlps(WP048359036.1)，擬南芥Arabidopsis thalianaNIP1-1(NP_567572.1)，玉米Zea maysPIP2-1 (NP_001105024.1)，水稻Oryza sativa SIP2-1(NP_001049950.1)，擬南芥AtTIP2-3(NP_199556.1).)

圖2PyAQP1與其他物種中的AQP家族基因的氨基酸序列比對

Fig.2ComparisonoftheaminoacidsequencesofPyAQP1andotherAQPproteins

(小球藻Auxenochlorella protothecoides (Glps)XP011400931.1, 小球藻A.protothecoides (Glps)XP011400934.1, 小立碗蘚 Physcomitrella patens (Glps)AAU43833.1, 單細(xì)胞紅藻 Cyanidioschyzon merolaestrain10D(Glps)XP005536496.1, 角叉菜 Chondrus crispus (Glps)CDF37343.1, 龍須菜 Gracilaria lemaneiformis (Glps)comp50806c0seq1 1-300, 條斑紫菜P.y (PyAQP1)KT735045, 單針藻 Monoraphidium neglectum (Glps)XP13897527.1, 溫泉紅藻Galdieria sulphuraria (Glps)XP005705771.1, 溫泉紅藻G.sulphuraria (Glps)EME29251.1, 金色藻ChrysochromulinaspCCMP291 (Glps)KOO24120.1, 假單胞菌Pseudomonas (Glps)WP018614182.1, 南極假單胞桿菌 P.deceptionensis (Glps)WP048359036.1, 熒光假單胞桿菌P. fluorescens (Glps)WP039765828.1, 土壤假單胞菌P.kilonensis (Glps)WP046062607.1, 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii (Glps)XP001694120.1, 單針藻 Mn (Glps)XP013897215.1, 甲烷熱桿菌 Methanothermobacter thermautotrophicus (AQPM)WP_010875742.1)

圖3PyAQP1水通道蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生分析

Fig.3ThephylogenetictreeofPyAQP1gene.

(a、d.洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞外觀圖；b、e.熒光顯微鏡下的綠色熒光信號圖；c、f.DAPI染色圖。a,d.Out-lookofonionepidermalcells;b,e.GreenfluorescentsignalunderFluo;c,f.DAPIstainingfigure.)

圖4PyAQP1亞細(xì)胞定位結(jié)果

Fig.4SubcellularlocalizationofPyAQP1fusedwithGFP

在鹽度處理條件下(見圖6)，低于正常海水鹽度下的超低滲(鹽度為8)與低滲(鹽度為16)，隨著鹽度的降低表達(dá)量增加，處理條件低于正常海水鹽度33時，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。當(dāng)高于正常海水鹽度的高滲(鹽度為47)與超高滲(鹽度為60)時，隨著鹽度的增加表達(dá)量也降低。當(dāng)海水鹽度為47時，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。當(dāng)海水鹽度為60時，PyAQP1的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化(P>0.05)。在滲透壓處理的條件中，增加了山梨醇的處理。低山梨醇處理條件的滲透壓與高滲處理條件下的滲透壓是一樣的，高山梨醇處理條件的滲透壓與超高滲滲透壓是一樣的。山梨醇處理后基因的表達(dá)情況與海水鹽度為47、海水鹽度為60處理條件下的表達(dá)趨勢是一樣的，隨著山梨醇濃度的增加，基因的表達(dá)量逐漸降低。在低山梨醇處理條件下，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，在高山梨醇處理的條件下，PyAQP1的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

溫度處理條件下，在-8℃時，基因的表達(dá)量顯著增加，約為正常處理條件下的30倍。在0 ℃時，基因的表達(dá)量略高于正常處理條件。當(dāng)溫度高于條斑紫菜生長的正常溫度時，基因的表達(dá)量隨著溫度的升高，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，且溫度處理20 ℃后，增加的趨勢較小(見圖7)。在溫度處理的各個節(jié)點(diǎn)處，PyAQP1表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

3　討論

近年來，AQP家族基因的功能已被廣泛的報道，但是在條斑紫菜中相關(guān)家族基因的功能研究尚未報道。本研究從條斑紫菜中克隆了一個AQP基因(PyAQP1)，其全長為1 351bp，含有1個內(nèi)含子，編碼蛋白氨基酸序列含有典型的MIP(Majorintrinsicprotein)家族中保守NPA結(jié)構(gòu)域，它們可能直接參與水通道蛋白通道的形成[13]。磷酸化是AQP活性調(diào)節(jié)的一種重要方式，研究表明植物AQP中的PIP、TIP和NIP等亞類都能夠被磷酸化，其磷酸化主要是發(fā)生于N端或C端的絲氨酸位點(diǎn)[10]。Nyblom等對菠菜水通道蛋白SoPIP2;1的研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白中絲氨酸的磷酸化可以明顯提高SoPIP2;1的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性[19]。本研究中 PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13個可能的磷酸化位點(diǎn)，其中8個位于絲氨酸(S)上，4個位于蘇氨酸(T)上，1個位于酪氨酸(Y)上(見圖1)，多個磷酸化位點(diǎn)的存在可能與PyAQP1功能的發(fā)揮有關(guān)，可增強(qiáng)AQP調(diào)控途徑的多樣性[20]。生物信息學(xué)預(yù)測與亞細(xì)胞定位均顯示，PyAQP1編碼蛋白主要定位于質(zhì)膜上，這與小立碗蘚中的Glps定位在質(zhì)膜上的結(jié)果是一致的[21]。Federico等指出Glps一般存在于低等生物藻類、苔蘚類中，Glps起源于細(xì)菌的水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)[22]。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，PyAQP1與紅藻中除溫泉紅藻的Glps聚為一支，而溫泉紅藻與綠藻中的小球藻(XP_013897527.1)聚為一支，并進(jìn)一步與假單胞菌聚在一起。同時綠藻的Glps也并未聚為明顯的獨(dú)立支，推測Glps在進(jìn)化上具有多重起源進(jìn)一步的研究需要證實(shí)Glps的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

水分脅迫是影響生物生長發(fā)育的重要脅迫因子。Alex等研究表明，擬南芥在自然干旱和250mmol/L甘露醇處理條件下，不同的AtPIP基因類型分別呈現(xiàn)出上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)模式[23-24]。Lian等發(fā)現(xiàn)，20%PEG6000處理抗旱水稻“中旱3號”10h后，水通道蛋白PIP表達(dá)增加，而不抗旱水稻“秀水63”的水通道蛋白PIP表達(dá)下降[25]。Sarda等研究發(fā)現(xiàn)，向日葵葉子中SunTIP7在缺水的情況下表達(dá)增加，而其根部的SunTIP1;8表達(dá)受到抑制[26-27]。本研究中，條斑紫菜在受到干出脅迫時，表達(dá)量都高于正常處理條件下的，但是隨著失水量的增加，表達(dá)量逐漸降低；在失水率達(dá)到80%后進(jìn)行復(fù)水，隨著復(fù)水時間的增加，表達(dá)量也呈現(xiàn)增加的趨勢。推測，條斑紫菜水分虧缺條件下，葉片中的水通道蛋白基因表達(dá)量升高，引起膜上的水通道蛋白密度增大，繼而增加了細(xì)胞-細(xì)胞途徑水分的運(yùn)輸，促進(jìn)藻體對水分的吸收。當(dāng)失水率達(dá)到一定程度后，編碼水通道蛋白的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量下降，推測是由于此時葉片中水通道蛋白含量已經(jīng)能滿足細(xì)胞-細(xì)胞途徑水分運(yùn)輸?shù)男枰?，且此時水通道蛋白活性的調(diào)控更為重要，從而促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞途徑的水分運(yùn)輸。在復(fù)水處理過程中，紫菜細(xì)胞有原來的失水狀態(tài)變成正常生理狀態(tài)，基因表達(dá)量增加并高于正常條件，原因可能在于二者細(xì)胞所處的微環(huán)境不同。正常條件下，細(xì)胞水分運(yùn)輸處于平衡失水后的復(fù)水恢復(fù)階段，細(xì)胞需水量瞬時增加，需要增加水通道蛋白量以增強(qiáng)細(xì)胞膜對水的通透能力。

鹽脅迫通過影響植物水通道蛋白的表達(dá)量和活性，來降低植物根系的吸水能力[28]。當(dāng)大麥?zhǔn)艿絅aCl脅迫后根部的HvPIP2;1表達(dá)量下降，但HvPIP1;3和HvPIP1;5的表達(dá)量未受到影響。Li等用150mmol·L-1NaCl處理水稻后，研究結(jié)果表明葉中OsTIP1;1、OsTIP4;1和OsTIP4;2表達(dá)量均先下降后上升，而OsTIP1;2 表達(dá)升高，OsTIP4;1, OsTIP4;2則是先下降后上升[29]。條斑紫菜自然生長于潮間帶，退潮后藻體暴露在空氣中，水分蒸發(fā)掉后，鹽度會增加。Real-timePCR結(jié)果顯示，在低于正常海水鹽度下，基因的表達(dá)量是高于正常處理條件的，隨著鹽度逐漸的降低，表達(dá)量呈現(xiàn)增加的趨勢；在高于正常海水鹽度下，基因的表達(dá)量高于正常處理條件，隨著鹽度的升高，表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢。推測，在低于海水鹽度下的環(huán)境中，條斑紫菜細(xì)胞內(nèi)的滲透勢高于外界環(huán)境，為維持細(xì)胞活性，紫菜細(xì)胞需要從外界吸收水分，水通道蛋白的表達(dá)量顯著增加。山梨醇處理對水通道蛋白的表達(dá)與鹽度處理的趨勢是一致的。

低溫脅迫會使植物細(xì)胞造成生理性缺水進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷[24]。研究表明，低溫脅迫下，植物水通道蛋白在轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出比干旱和高鹽更為復(fù)雜的情況，其中涉及水通道蛋白的種類與干旱和高鹽度脅迫相比更為多樣化，PIP、NIP、TIP和SIP基因表達(dá)都受到脅迫條件的影響且表達(dá)模式相同[24]。Jang等對擬南芥中的PIP亞家族成員的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明13個PIP基因?qū)涿{迫產(chǎn)生響應(yīng)，除了AtPIP2;5表達(dá)呈上升趨勢外，其余的12個PIP基因表達(dá)都受到抑制[30]。Sakurai等發(fā)現(xiàn)水稻中多數(shù)水通道蛋白在受到低溫脅迫時表達(dá)受抑制，隨著溫度增加，表達(dá)逐漸增加[31]。條斑紫菜葉狀體的生長發(fā)育階段主要在冬季，最低溫度可達(dá)8 ℃，保持藻體水分平衡對其存活來說至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示低溫與高溫處理均使其表達(dá)量增加，推測在低溫與高溫處理時，藻體通過大量的表達(dá)水通道蛋白來維持葉片導(dǎo)水率以及體內(nèi)水分運(yùn)輸，減少植株所受溫度脅迫。

4　結(jié)語

本研究從條斑紫菜中克隆了一個水通道蛋白基因PyAQP1，開放閱讀框為1 002bp，編碼一個含333個氨基酸殘基的多肽，定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，進(jìn)化分析結(jié)果顯示PyAQP1屬于Glps類。在失水、鹽度、溫度脅迫下該基因都上調(diào)表達(dá)。條斑紫菜作為一種研究潮間帶藻類生理生態(tài)以及逆境脅迫適應(yīng)機(jī)制的代表性模式物種，本文對水通道蛋白的研究能夠為揭示條斑紫菜逆境適應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯高蓓

CloningandExpressionAnalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis

YANGJun-Qing1,KONGFan-Na1,LIChao1,BIGui-Qi1,SUNMei-Juan2，ZHAOHai-Long1,LINa1,MAOYun-Xiang1

(1.TheKeyLaboratoryofMarineGeneticsandBreeding,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China;2.DepartmentofPharnacy,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Aquaporinsareancientchannelproteinslocalizedinbiologicalmembranesandfacilitatingwatertransportthroughcellmembranesrapidly.Aquaporinplaysanimportantroleinplantwaterhomeostasisthroughthefacilitationofwatertransportandsolutes.TheredmacroalgaeP. yezoensis,classifiedasBangiophyceae,isasuitablespeciesfortheelucidationofmolecularmechanismsregulatingenvironmentalstressesinmarineredalgae.However,currentlylittleisknownabouttheAQPgenesinP. yezoensis.APyAQP1gene(GINumberisKT735045)wasisolatedthroughtsilicoclone,basedonthetranscriptomicdatainthisresearch.ThefulllengthofPyAQP1containedoneintronwiththesizeof200bp,andanopenreadingframeof1 151bpencoding333aminoacids.Theisoelectricpoints(PI)andmolecularweights(MW)ofthePyAQP1aminoacidsequencewere35.4kDand6.43,respectively.TheanalysisofPyAQP1aminoacidsequencesshowedthatPyAQP1containedtheMIPfamilysignatureNPAmotifaswellassixtransmembraneregions.AnalysisofmultiplesequencealignmentandphylogenetictreeshowedthatPyAQP1sharedverylowsimilaritytoanyotherplantMIPbutasurprisinglyhighsimilaritytoasubclassofbacterialGlps.TheplasmidconstructencodingPyAQP1-GFPunderthecontrolofthe35Spromoterwastransformedintoonionepidermalcellsbyparticlebombardment.ThetransientexpressionanalysisinonionepidermalcellsshowedusthatthePyAQP1proteinwaslocalizedinthecellplasmamembrane,comparedtothecontrol35S::GFPinthenucleus,cytoplasmandplasmamembraneofthecells.Tobetterunderstandtheshort-termexpressionpatternsofPyAQP1inresponsetoabioticstress,qRT-PCRwasusedtoinvestigatetheexpressionpatternsofPyAQP1indifferenttreatmentconditions(salt,droughtandtemperature).Underdroughtstress,theexpressionlevelofPyAQP1decreasedwiththeincrementofthewaterlossrate.Itwasnotingthattheexpressionincreasedwhenrehydrationafterdehydrationreached80%.TheexpressionpatternsofPyAQP1undersorbitolandNacltreatmentwassimilarandtheexpressionlevelofPyAQP1decreasedwithsalinityincreasing.Undertemperaturestress,theexpressionofPyAQP1increasedsignificantlyat-8 ℃,andtheexpressionat0 ℃wasslightlyhigherthannormaltreatment.However,theexpressionofPyAQP1graduallyincreasedwiththetemperatureincreasing,whengrowthtemperatureincreasesby10 ℃.Inthiswork,wereportedtheisolationandexpressioncharacterizationofthePyAQP1geneintheP. yenozesis,whichprovidetheinsightsforunderstandingthemechanismsofPyAQP1respondingtoabioticstresses.

Pyropia yezoensis;aquaporin;subcellularlocalization;Realtime-PCR;abioticstress

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A401；2012AA10A406)資助

2015-12-25；

2016-03-21

楊俊卿(1990-)，女，碩士生。E-mail:yjqouc@163.com

**通訊作者：E-mail:fnkong@ouc.edu.cn

Q945.78

A

1672-5174(2016)08-079-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150425

SupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(2012AA10A401;2012AA10A406)