岳　東， 張曉雪， 趙　飛， 汝少國

(中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

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久效磷對斑馬魚胚胎期心臟和骨骼發(fā)育的毒性效應研究*

岳東， 張曉雪， 趙飛， 汝少國**

(中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

有機磷農(nóng)藥具有一定的胚胎發(fā)育毒性，以往有機磷農(nóng)藥胚胎發(fā)育毒性的研究主要集中于個體水平。本研究以斑馬魚(Danio rerio)作為受試生物，采用0.000 4、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷自受精卵暴露斑馬魚胚胎至受精后96h(96hpf)。研究結(jié)果表明,久效磷對胚胎的存活率、孵化率均無顯著影響，但顯著降低了36hpf胚胎的心率，96hpf仔魚心包囊腫率和脊柱彎曲率顯著升高；久效磷暴露胚胎至48hpf顯著降低了心臟發(fā)育相關(guān)基因(Tbx2)的表達水平、顯著升高了肌肉發(fā)育相關(guān)基因(Mef2c)的表達水平?？梢?，久效磷能夠在個體和分子水平上影響斑馬魚胚胎心臟和骨骼的發(fā)育，對斑馬魚胚胎心臟和骨骼的發(fā)育具有毒性效應。

久效磷；斑馬魚；發(fā)育毒性；心臟；骨骼

引用格式：岳東， 張曉雪， 趙飛， 等. 久效磷對斑馬魚胚胎期心臟和骨骼發(fā)育的毒性效應研究[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(8): 72-78.

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有機磷農(nóng)藥作為有機氯類殺蟲劑替代品在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用，但在使用過程中會隨雨水沖刷等途徑進入河流、湖泊和海洋，造成水體污染，對水生生物構(gòu)成威脅。有機磷農(nóng)藥久效磷(MCP)曾廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，但其大量使用也產(chǎn)生了很多環(huán)境問題，據(jù)報道久效磷與阿根廷斯溫氏鷹(Buteo swainsoni)的死亡有關(guān)[1]，另有報道顯示久效磷對鳥類、蜜蜂等具有極高毒性，對魚類等具有中毒[2]。由于危害嚴重，已在很多國家禁止使用，在國際農(nóng)藥行動網(wǎng)的高危害農(nóng)藥列表(2010)中，久效磷被要求全球淘汰。中國自2007年1月1日起全面禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用，但仍能檢測到其殘留，如在中國某水源地久效磷含量為0.165μg/L[3]，2010年武漢市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測站發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自西部某市的荷蘭豆樣品中含有久效磷農(nóng)藥[4]；在印度雨水和巴基斯坦四大棉花密集種植區(qū)的淺層地下水中檢測到的久效磷殘留濃度分別高達4和8.3μg/L[5-6]。久效磷農(nóng)藥具有胚胎毒性，能夠?qū)е卵丽遗咛シ趸式档蚚7]和小鼠胚胎死胎率升高[8]，嚴重影響體外培養(yǎng)小鼠胚胎的發(fā)育，導致囊胚期胚胎內(nèi)細胞團形態(tài)發(fā)育異常以及細胞數(shù)目的減少[9]；吡唑硫磷等能夠引起動物胚胎心包囊腫以及骨骼彎曲[10-12]，然而久效磷是否能夠引起類似的效應目前還未知。在胚胎發(fā)育過程中，關(guān)鍵基因的表達變化會導致心臟、骨骼等發(fā)育異常[13-14]。很多基因參與調(diào)控脊椎動物胚胎心臟和骨骼的發(fā)育過程：T-box家族基因參與調(diào)控脊椎動物心臟的發(fā)育[15]，其中，心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2在心臟形成的早期階段發(fā)揮重要作用[16-17]；肌肉發(fā)育相關(guān)基因Mef2c是參與調(diào)控心肌和骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵基因之一[18-20]，以往還未見結(jié)合關(guān)鍵基因的表達變化探究有機磷農(nóng)藥對胚胎心臟和骨骼發(fā)育毒性潛在機制的研究報道。因此，本文以斑馬魚胚胎為實驗對象，在個體和分子水平上探討了久效磷對斑馬魚胚胎期心臟和骨骼發(fā)育的毒性效應及潛在機制。

1　材料與方法

1.1 實驗用魚

將實驗室自行培養(yǎng)的12月齡性成熟T系斑馬魚雌雄分開，分別馴養(yǎng)于30L水族箱中，加入連續(xù)曝氣24h以上的脫氯自來水，馴養(yǎng)條件為：水溫(28±1) ℃，溶解氧(7.0±0.1)mg/L，pH=7.6±0.2，光照周期14h∶10h。每天喂食豐年蝦(實驗室孵化)2次，換水4/5。馴養(yǎng)1個月后，按1∶2比例選擇懷卵雌魚和健康雄魚撈入自制產(chǎn)卵小室中進行產(chǎn)卵。次日，待親魚產(chǎn)卵完畢后收集健康的受精卵用于暴露實驗。

1.2 久效磷暴露實驗

久效磷(Monocrotophos)純品購自(Sigma-Aldrich,Shanghai,China)，純度為99.3%。實驗過程中配制濃度為0.1g/L儲備液，4 ℃避光保存，每周更新儲備液一次。采用2L燒杯盛放1L曝氣自來水，久效磷暴露濃度設置為0、0.000 4、0.004、0.04和0.4mg/L，每個濃度設置2個燒杯，每天換水1/2，每個燒杯中放入150枚受精卵，實驗條件同馴養(yǎng)條件。

自暴露開始至72hpf，每隔12h清理燒杯內(nèi)的死卵(胚胎變白，不透明)并統(tǒng)計胚胎的存活率，同時統(tǒng)計48、60、72hpf3個時間節(jié)點的胚胎孵化率。存活率(%)=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%，孵化率(%)=已孵化胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。暴露至48、60hpf，取燒杯中的胚胎或孵化出的仔魚吸盡水分置于1.5mL離心管中，每25條仔魚混作一個樣品(n=4)，將樣品液氮速凍，爾后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，用于基因表達水平的測定。暴露至96hpf將燒杯中的仔魚用10%甲醛固定，在顯微鏡(OlympusCX31,JAPAN)下觀察記錄仔魚的畸形情況并進行拍照。計算公式如下：

畸形率(%)=畸形胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

斑馬魚心率統(tǒng)計在24孔板中完成，準備5個24孔板，濃度設置與燒杯一致，每個板上設置同一個濃度。每孔加入3mL暴露液并放置2枚受精卵。每天更換一半暴露液，并清除死卵。暴露至36hpf將24孔板置于顯微鏡(OlympusCX31,JAPAN)下統(tǒng)計胚胎20s內(nèi)的心跳數(shù)。

1.3 基因表達分析

用E.Z.N.A.TMMicroEluteTotalRNAKit(OmegaBio-Tek,USA)進行總RNA抽提。提取所得總RNA用NanoDrop2000c紫外分光光度計(ThermoScientific,USA)測定RNA質(zhì)量及濃度。等量的總RNA(1μg)通過PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,Shiga,Japan)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有操作均嚴格按照試劑盒說明進行。根據(jù)Genbank已發(fā)表的序列，采用引物設計軟件PrimerPremier5.0software(PREMIERBiosoftInt.PaloAlto,USA)依照qPCR的引物設計原則[21]設計目的基因Tbx2、Mef2c的特異性引物 (見表1)，β-actin(內(nèi)參)的特異性引物參考Zhang等[22]。用SYBRPremixExTaqTMIIKit(TaKaRa,Shiga,Japan)進行實時定量PCR，采用兩步法進行real-timePCR反應，程序設置為：95 °C30s；95 °C5s，60 °C30s，40cycles；為判斷引物特異性設置熔解曲線反應，程序設置為：95 °C15s，60 °C60s，95 °C15s，每隔0.5 °C讀取一次熒光值。采用參照基因的2-△△Ct法計算目的基因表達量，以β-actin作為內(nèi)參基因，歸一化處理反應體系中的基因擴增，按以下公式：

目的基因相對表達量=log2(2Ct(修正內(nèi)參基因)-Ct(目的基因)+1)。

表1 Tbx2、Mef2c、β-actin real-time PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

各組數(shù)據(jù)均用平均值±標準差(Mean±SD)表示。應用SPSS(version19.0；SPSSInc.，Chicago，IL)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。首先用Levene’stest對數(shù)據(jù)進行方差同質(zhì)性檢驗，然后采用One-WayANOVA和Tukey’smultiplerangetest檢驗處理組與對照組之間的統(tǒng)計學差異，0.01

2　結(jié)果

2.1 久效磷對斑馬魚胚胎存活率和孵化率的影響

久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf，各暴露組斑馬魚胚胎的存活率和孵化率與對照組相比均無顯著性差異(見圖1)。

圖1　久效磷對斑馬魚(Danio rerio)胚胎存活率(A)、孵化率(B)的影響

2.2 久效磷對斑馬魚胚胎心率的影響

久效磷暴露斑馬魚胚胎至36hpf，0.000 4、0.004和0.4mg/L暴露組斑馬魚胚胎20s內(nèi)的心跳數(shù)顯著減少(P<0.05)，而0.04mg/L暴露組斑馬魚胚胎的心跳數(shù)與對照組相比無顯著差異(見圖2)。

(*P<0.05)

2.3 久效磷對斑馬魚胚胎心臟和脊柱發(fā)育的影響

久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf，各暴露組仔魚均出現(xiàn)心包囊腫和脊柱彎曲現(xiàn)象，且隨著暴露濃度的增加，心包囊腫和脊柱彎曲癥狀的嚴重程度增加(見圖3、4)。經(jīng)統(tǒng)計，各暴露組與對照組相比仔魚心包囊腫率均顯著升高(P<0.05)(見圖5)；0.000 4mg/L暴露組仔魚脊柱彎曲率與對照組相比無顯著差異，0.004mg/L暴露組仔魚脊柱彎曲率顯著升高(P<0.05)，0.04和0.4mg/L暴露組仔魚脊柱彎曲率極顯著升高(P<0.01)(見圖5)。

2.4 久效磷暴露對斑馬魚心臟、肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

久效磷暴露斑馬魚胚胎至48hpf，0.04和0.4mg/L暴露組Tbx2基因的表達水平極顯著降低(P<0.01)，其余暴露組Tbx2基因的表達水平與對照組相比無顯著變化；暴露至60hpf，各暴露組Tbx2基因的表達水平與對照組相比均無顯著變化(見圖6)。

圖3　久效磷暴露斑馬魚(Danio rerio)胚胎至96 hpf引起心包囊腫

久效磷暴露斑馬魚胚胎至48hpf，0.4mg/L暴露組Mef2c基因的表達水平顯著升高(P<0.05)，其余暴露組Mef2c基因的表達水平與對照組相比無顯著變化；久效磷暴露至60hpf，各暴露組Mef2c基因的表達水平與對照組相比均無顯著變化(見圖6)。

圖4　久效磷暴露斑馬魚(Danio rerio)胚胎至96 hpf引起脊柱彎曲

(*P<0.05，**P<0.01)

(*P<0.05，**P<0.01)

3　討論

存活率、孵化率、心跳、心包囊腫和脊柱彎曲等是斑馬魚胚胎試驗中常用的毒理學終點[23-24]。本研究中久效磷暴露對斑馬魚胚胎的存活率和孵化率沒有影響，但對斑馬魚胚胎的心臟和骨骼發(fā)育產(chǎn)生了毒性效應。研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf，仔魚心臟發(fā)育畸形，出現(xiàn)心包囊腫現(xiàn)象，這與之前吡唑硫磷[10]、馬拉硫磷、對硫磷[11]暴露導致斑馬魚胚胎產(chǎn)生心包囊腫的結(jié)果相似。心包囊腫具有不可逆性，一旦形成就難以自然消失[12]，因此，久效磷暴露斑馬魚胚胎引起的心包囊腫會一直存在于個體發(fā)育過程中，能夠造成仔魚心臟的結(jié)構(gòu)異常和功能缺失，甚至威脅到斑馬魚的生存。久效磷除了影響斑馬魚的心臟結(jié)構(gòu)外，還損害了斑馬魚心臟的功能。心率是心臟功能評價最靈敏的指標[25]，研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露降低了36hpf胚胎的心率。本研究結(jié)果表明久效磷能夠在結(jié)構(gòu)和功能上影響斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育，對斑馬魚胚胎的心臟發(fā)育具有明顯的毒性作用。

Tbx2基因在心臟形成的早期階段發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]，Tbx2基因能夠通過阻礙心室的異常發(fā)育和細胞的異常增殖來保證心室的正常收縮，調(diào)控心臟的形態(tài)發(fā)生過程[17]；斑馬魚胚胎Tbx2基因表達受抑制，會導致心包囊腫等形態(tài)學異常以及心室發(fā)育不良[16]。本研究檢測了心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2表達量的變化，發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚胚胎至48hpf，0.04和0.4mg/L暴露組Tbx2基因的表達水平極顯著降低，相應暴露組斑馬魚仔魚的心包囊腫率顯著上升，說明久效磷可能通過調(diào)控Tbx2基因的表達影響心臟的發(fā)育，誘發(fā)心包囊腫。0.000 4和0.004mg/L暴露組斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包囊腫，而相應暴露組Tbx2基因的表達水平卻沒有顯著變化，可能是由于久效磷對Tbx家族其它基因的影響。斑馬魚中，Tbx2與Tbx3二者之一的異常表達，就能夠?qū)е滦呐K細胞分裂能力的降低[26]，對心臟的發(fā)育產(chǎn)生影響。較低濃度久效磷是否主要通過影響Tbx3基因的表達來誘導斑馬魚心臟的發(fā)育異常，還有待進一步驗證。久效磷暴露斑馬魚胚胎至60hpf，對Tbx2基因表達無明顯影響，可能與此時期斑馬魚心臟發(fā)育已經(jīng)完成有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，久效磷對不同發(fā)育階段的斑馬魚GH基因表達的影響是不同的[27]，說明基因?qū)ν庠次镔|(zhì)的敏感性以及應答方式與是否處于該基因的功能時期有關(guān)。本研究中，久效磷暴露對48hpf斑馬魚胚胎Tbx2基因的表達具有抑制作用，而對60hpfTbx2基因的表達無明顯影響，說明調(diào)控心臟發(fā)育的Tbx2基因在心臟發(fā)育過程中可能對久效磷更為敏感。

吡唑硫磷[10]、馬拉硫磷[11]、苯硫磷[12]暴露斑馬魚胚胎能夠?qū)е律眢w彎曲，本研究結(jié)果顯示久效磷對斑馬魚胚胎的骨骼發(fā)育同樣具有毒性效應。久效磷暴露斑馬魚胚胎至96hpf，導致仔魚脊柱彎曲，且隨著久效磷暴露濃度的增加，脊柱彎曲的癥狀加劇。骨骼彎曲會影響魚類的游泳行為[28]，本實驗觀察到輕度的脊柱彎曲就能夠影響斑馬魚的運動行為，且隨著脊柱彎曲程度的加重，斑馬魚的運動能力明顯下降，有些嚴重變形個體因無法游動而停留在燒杯底。本研究結(jié)果表明久效磷對斑馬魚胚胎脊柱發(fā)育具有致畸效應，并能影響斑馬魚仔魚的運動行為。

骨骼肌收縮對于骨骼的正常生長具有重要的作用[29]，而骨骼肌的發(fā)育異常能夠?qū)е鹿趋郎L異常。肌肉發(fā)育相關(guān)基因Mef2c是參與調(diào)控心肌和骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵基因之一[18-20]。本研究通過檢測Mef2c基因表達量的變化，從探究久效磷對斑馬魚胚胎骨骼肌發(fā)育影響的角度，進一步探究久效磷對斑馬魚胚胎脊柱發(fā)育毒性影響的潛在機制。研究中0.4mg/L久效磷暴露斑馬魚胚胎至48hpf顯著促進了Mef2c基因的表達，同時發(fā)現(xiàn)0.4mg/L久效磷暴露導致斑馬魚仔魚脊柱彎曲，表明Mef2c基因表達的變化會影響骨骼肌的發(fā)育從而導致仔魚脊柱彎曲。但是其余暴露組也出現(xiàn)仔魚脊柱彎曲現(xiàn)象，而對應暴露組斑馬魚胚胎的Mef2c基因表達量并未出現(xiàn)顯著差異變化，由此推測久效磷暴露可能并不只是通過影響Mef2c基因的表達來影響骨骼肌發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，其他肌肉發(fā)育相關(guān)基因(如MyoD、Myf5[30-31]等)在骨骼肌發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，因此，可以進一步探究久效磷是否通過改變這些基因的表達水平進而影響骨骼發(fā)育。

從研究結(jié)果可以看出，在久效磷暴露后，在0.000 4和0.004mg/L處理組斑馬魚仔魚即出現(xiàn)心包囊腫和脊柱彎曲現(xiàn)象，仔魚心包囊腫率和脊柱彎曲率與對照比相比也均顯著升高；2個處理組的胚胎20s內(nèi)的心跳數(shù)也顯著減少。有報道巴基斯坦四大棉花密集種植區(qū)的淺層地下水中檢測到的久效磷殘留濃度高達8.3μg/L[6]，在印度Lucknow市工業(yè)廢水中檢測到的久效磷濃度達到(8.32±3.9)μg/L[32]。由此可見，久效磷的環(huán)境濃度已經(jīng)足夠?qū)λ锏男呐K和骨骼發(fā)育產(chǎn)生毒性效應，因此，環(huán)境中久效磷的污染問題應該引起重視。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)久效磷暴露斑馬魚胚胎后干擾了心臟發(fā)育相關(guān)基因Tbx2和肌肉發(fā)育相關(guān)基因Mef2c的表達，從而導致斑馬魚心臟和骨骼的發(fā)育不良，出現(xiàn)心包囊腫和脊柱彎曲現(xiàn)象，從而證明了久效磷對斑馬魚胚胎的心臟和骨骼發(fā)育具有致畸效應。

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責任編輯高蓓

StudyoftheToxicityofMonocrotophosontheCardiacandSkeletalDevelopmentofDanio rerioEmbryos

YUEDong,ZHANGXiao-Xue,ZHAOFei,RUShao-Guo

(CollegeofMarineLife,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Monocrotophos(MCP,CASnumber6923-22-4),anorganophosphatepesticide,canadverselyaffectthenormaldevelopmentofmammalembryos,however,itstoxicityontheheartandskeletondevelopmentsoffishembryoshasnotbeenreported.Moreover,previousresearchesontheembryotoxicityoforganophosphoruspesticidesweremainlyperformedattheindividuallevel,withfewstudiescombiningwithmolecularindicatorstofurtherexploretheunderlyingmechanisms.Therefore,usingzebrafishasthemodelanimal,thetoxicityofMCPontheheartandskeletondevelopmentwasinvestigatedatboththeindividualandmolecularlevelsinthisstudy.Embryoswereexposedto0.000 4, 0.004, 0.04and0.4mg/Lmonocrotophosfrom0hpostfertilization(hpf)to96hpf.Theresultsshowedthatcomparedwiththecontrolgroup,therewerenosignificantchangesforthesurvivalandhatchingratesofembryosinalltreatmentgroups.However,pericardialcystwasobservedinlarvaeexposedtoMCPat96hpf,withthefrequenciesofthisdeformitysignificantlyincreasedinalltreatmentgroups.Meanwhile,theheartbeatfrequenciesdecreasedsignificantlyat36hpfinthe0.000 4, 0.04and0.4mg/Ltreatmentgroups.OurdataindicatedamagesonthestructureandfunctionofthezebrafishheartscausedbyMCPexposure.ItisreportedthatabnormalmorphologiessuchaspericardialcystandventriculardysplasiawouldbeinducedwhenTbx2geneexpressionissuppressedinzebrafishembryos.ConsideringthemRNAexpressionsofTbx2decreasedsignificantlyinthe0.04and0.4mg/Ltreatmentgroupsat48hpf,wededucedthathighconcentrationsofMCPmayaffecttheheartdevelopmentthroughinhibitingthegeneexpressionofTbx2,atleastpartly.ThefactthatmRNAexpressionsofTbx2werenotchangedbyMCPat60hpfmaybeexplainedbythecompletionofheartdevelopmentatthistimepoint.Inaddition,theskeletondevelopmentofembryoswasalsoaffectedbyMCP,withthepercentagesofspinalcurvatureincreasedsignificantlyby0.004～0.4mg/LMCPat96hpf.MuscledevelopmentrelatedgeneMef2cisoneofthekeygenesresponsibleforthenormaldevelopmentofskeletalmuscles,whichplaysanimportantroleinbonegrowth.OurresultsfoundthatthemRNAexpressionsofMef2cincreasedsignificantlyinthe0.4mg/Ltreatmentgroupsat48hpf,thusitcouldbespeculatedthatMCPmayimpactthedevelopmentofskeletalmusclebydisturbingthenormalexpressionpatternofMef2c.However,othergeneslikeMyoDandMyf5shouldbefurtherinvestigatedinfuturestudies,asmRNAexpressionsofMef2cexhibitednosignificantchangesinothertreatmentgroups.Inconclusion,thisstudyprovidedbasicinformationonthetoxicityofMCPontheheartandskeletondevelopmentoffishembryosatboththeindividualandmolecularlevels.

Monocrotophos;zebrafish;developmenttoxicity;heart;skeleton

高等學校博士學科點專項科研基金項目(20120132110011)資助

2015-12-22；

2016-03-21

岳東(1989-)，男，碩士，研究方向為生態(tài)毒理學。E-mail:ydy214@126.com

**通訊作者：E-mail：rusg@ouc.edu.cn

X171.5

A

1672-5174(2016)08-072-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150410

SupportedbytheResearchFundfortheDoctoralProgramofHigherEducationofChina(20120132110011)