余化龍，何寧，劉志剛，熊敏

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院,湖北十堰442008)

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合EPO對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的影響及機(jī)制探討

余化龍，何寧，劉志剛，熊敏

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院,湖北十堰442008)

目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素(EPO)治療急性脊髓損傷的效果，并探討其作用機(jī)制。方法采用腦紅蛋白(Ngb)基因重組綠色熒光蛋白-腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，構(gòu)建Ngb基因修飾的BMSCs。取成年雄性SD大鼠80只制作脊髓損傷模型，分為聯(lián)合組、EPO組、BMSCs組、對(duì)照組各20只，聯(lián)合組于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受損脊髓中點(diǎn)及受損中點(diǎn)上下5 mm注入Ngb基因轉(zhuǎn)染的BMSCs各5 μL；EPO組于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含細(xì)胞的培養(yǎng)基；BMSCs組于造模前1 d腹腔注射等量生理鹽水，造模后脊髓注入等量Ngb基因轉(zhuǎn)染BMSCs；對(duì)照組僅在脊髓損傷前1 d經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水，造模后在受損脊髓中注射等量不含細(xì)胞培養(yǎng)基。分別于干預(yù)1、3、7、14、21 d，采用BBB評(píng)分法評(píng)價(jià)各組神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)脊髓Ngb 蛋白表達(dá)。結(jié)果干預(yù)1、3、7、14、21 d聯(lián)合組BBB評(píng)分均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，P均<0.05；干預(yù)1、3、7、14、21 d聯(lián)合組Ngb相對(duì)表達(dá)量均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，P均<0.05；干預(yù)3、7、14、21 d BMSCs組Ngb相對(duì)表達(dá)量均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，P均<0.05；干預(yù)3、7、14、21 d EPO組Ngb相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，P均<0.05。結(jié)論 Ngb基因修飾的BMSCs聯(lián)合EPO可明顯提高急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，可能與促進(jìn)Ngb表達(dá)有關(guān)。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；促紅細(xì)胞生成素；脊髓損傷；腦紅蛋白

脊髓損傷是臨床常見的神經(jīng)損傷，致殘率和致死率均較高[1, 2]。其預(yù)后較差，多數(shù)患者的運(yùn)動(dòng)、感覺恢復(fù)情況均不理想。因此，尋求一種較好的恢復(fù)脊髓功能的治療手段是目前的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，細(xì)胞移植以及基因治療為脊髓損傷的治療提供了新思路[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可分泌促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的因子，促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[4]。腦紅蛋白(Ngb)是人們發(fā)現(xiàn)的第3種攜氧球蛋白，主要定位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)[5]，可作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子。既往研究發(fā)現(xiàn)，Ngb基因修飾的BMSCs可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷恢復(fù)[6, 7]。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，目前常用于脊髓損傷的治療[8]。2015年6～12月，我們觀察了Ngb基因修飾的BMSCs聯(lián)合EPO對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的影響，并探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料大鼠BMSCs由本實(shí)驗(yàn)室分離與培養(yǎng)。成年SD大鼠80只，體質(zhì)量220～240(225±8)g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。293細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院分子生物學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。Ad-GFP質(zhì)粒購(gòu)買于Invitrigen公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國(guó))，倒置相差顯微鏡(Olympus,日本)，低溫離心機(jī)(Heraeus,德國(guó))，胎牛血清(Gibco)，TRIzol(Invitrogen,美國(guó))，SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co Ltd,日本)，ReverTra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo Co. Ltd,日本)，Hanks(自制)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锛夹g(shù)公司),β-actin (1∶1 000，Santa Cruz,美國(guó)), Ngb(1∶1 000，Santa Cruz,美國(guó))，RIPA蛋白提取液(博士德，武漢)，BCA蛋白定量試劑盒(博士德，武漢)。

1.2Ngb基因修飾的BMSCs構(gòu)建采用Ngb基因重組綠色熒光蛋白-腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染BMSCs構(gòu)建Ngb基因修飾的BMSCs。Ad-GFP質(zhì)粒PacⅠ線性化后LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，7～10 d后收集細(xì)胞。-70 ℃、37 ℃反復(fù)凍融，離心收集上清，獲取初毒，同法進(jìn)行大量擴(kuò)增。氯化銫純化病毒，倍比稀釋法檢測(cè)病毒滴度(PFU)。取3次傳代的BMSCs按1×105/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液。以最佳MOI值的Ngb重組慢病毒，按不同MOI值加入pAdEasy-GFPCXCRGFP Ngb病毒液，于37 ℃、95%飽和濕度、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。感染后每天用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，隨機(jī)取5 個(gè)200 倍視野，計(jì)數(shù)綠色熒光表達(dá)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，求其平均值為感染率。每一MOI 值測(cè)3個(gè)感染率，計(jì)算細(xì)胞感染率在80%以上時(shí)需要的病毒量來(lái)確定最適感染MOI 值。感染BMSCs，并制備濃度為1×106/mL的BMSCs懸液，備用。

1.3 模型構(gòu)建及分組干預(yù)取成年雄性SD大鼠80只，麻醉后仰臥位固定。在T10椎板水平附近消毒上下各5 cm，逐層分離皮膚、皮下脂肪以及椎旁肌肉；用咬骨鉗將棘突和終板去除暴露脊髓，用脊髓損傷打擊器造成脊髓損傷模型[9]。以大鼠脊髓出血水腫、后肢出現(xiàn)遲緩性癱瘓和尾巴痙攣性擺動(dòng)為造模成功。逐層縫合傷口后給予青霉素預(yù)防感染，分籠飼養(yǎng)，80只大鼠均造模成功。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為聯(lián)合組、EPO組、BMSCs組、對(duì)照組各20只，聯(lián)合組于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受損脊髓中點(diǎn)及受損中點(diǎn)上下5 mm注入Ngb基因轉(zhuǎn)染的BMSCs各5 μL；EPO組于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含細(xì)胞的培養(yǎng)基；BMSCs組于造模前1 d腹腔注射等量生理鹽水，造模后脊髓注入等量Ngb基因轉(zhuǎn)染BMSCs；對(duì)照組僅在脊髓損傷前1 d經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水，造模后在受損脊髓中注入等量不含細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.4大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)分別于干預(yù)后1、3、7、14、21 d每組各取4只大鼠，膀胱排空后置于直徑 1 m的光滑平面自由活動(dòng)5 min。采用BBB評(píng)分量表評(píng)價(jià)各組大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，評(píng)分越高說(shuō)明神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)越好。

1.5脊髓Ngb 蛋白檢測(cè)取1.5中各時(shí)段大鼠，斷頭處死后取脊髓備用。使用RIPA蛋白提取液提取脊髓總蛋白，SDS-PAGE電泳；5%去脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，一抗分別為β-actin、Ngb；用辣根過(guò)氧化物酶共軛的二抗室溫孵育2 h，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。所有操作嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1各組BBB評(píng)分比較見表1。

2.2各組Ngb蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表2。

表1　干預(yù)1、3、7、14、21 d各組BBB評(píng)分比較

注：與EPO組、BMSCs組、對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2　干預(yù)1、3、7、14、21 d各組Ngb 蛋白表達(dá)量比較

注：與EPO組、BMSCs組、對(duì)照組比較，*P<0.05；與EPO組、對(duì)照組比較，△P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05。

3　討論

脊髓損傷是脊柱外傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙。脊髓損傷不僅會(huì)給患者本人帶來(lái)身體和心理的嚴(yán)重傷害，還會(huì)對(duì)整個(gè)社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。脊髓組織的直接機(jī)械損傷通常會(huì)導(dǎo)致部分或全部的神經(jīng)功能喪失，如感覺麻痹或運(yùn)動(dòng)功能喪失。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，車禍傷、高處墜落傷以及暴力事件是脊髓損傷的最常見誘因，分別占36.5%、28.5%和14.3%[10,11]。由于神經(jīng)元細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，故針對(duì)脊髓損傷的治療一直未取得突破性進(jìn)展。目前,脊髓損傷的治療主要集中在急性反應(yīng)期針對(duì)炎癥反應(yīng)避免神經(jīng)元軸突的二次損傷，以及損傷后針對(duì)神經(jīng)的再生和修復(fù)[12, 13]。隨著基因治療和細(xì)胞移植的發(fā)展，尋找有效的目的基因是人們研究的熱點(diǎn)。Ngb是人體內(nèi)第3種攜氧球蛋白，分子量為17 kD，因其主要在腦組織中表達(dá)而得名，定位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)。近年來(lái)在腦損傷的研究中發(fā)現(xiàn),Ngb是神經(jīng)系統(tǒng)特異性攜氧珠蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控因子,可作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，對(duì)腦缺血缺氧性損傷、創(chuàng)傷性顱腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有很好的神經(jīng)保護(hù)作用，外源性Ngb 也具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)1 d聯(lián)合組BBB評(píng)分均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，原因可能是在脊髓損傷早期Ngb可以發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)神經(jīng)的作用。干預(yù)1、3、7、14、21 d聯(lián)合組Ngb相對(duì)表達(dá)量均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，干預(yù)3、7、14、21 d BMSCs組Ngb相對(duì)表達(dá)量均高于EPO組、BMSCs組、對(duì)照組，干預(yù)3、7、14、21 d EPO組Ngb蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)各組BBB評(píng)分，我們發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷早期(干預(yù)1 d)，各組治療除聯(lián)合組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Antao等[14]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，增加神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ngb表達(dá)可以減輕細(xì)胞損傷后繼發(fā)的線粒體異常，抑制線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率。而當(dāng)脊髓損傷后，攜帶Ngb基因的BMSC可以定向歸巢到損傷部位，持續(xù)分泌Ngb，對(duì)損傷神經(jīng)進(jìn)行再生修復(fù)，而EPO可以促進(jìn)損傷處血管再生，為BMSCs的歸巢和發(fā)揮作用提供了路徑。這可能是聯(lián)合治療優(yōu)于單獨(dú)治療的原因之一。病毒轉(zhuǎn)染Ngb基因的BMSCs可以高水平的分泌Ngb蛋白，在急性脊髓損傷組織中發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性的Ngb基因?qū)τ趧?chuàng)傷性顱腦損傷以及缺血缺氧性神經(jīng)功能的恢復(fù)發(fā)揮了重要作用。有研究證實(shí)，在顱腦損傷后Ngb表達(dá)量會(huì)增加，而且表達(dá)量與時(shí)間成正比;EPO治療并不會(huì)增加Ngb表達(dá)，EPO治療急性脊髓損傷的機(jī)制可能是EPO僅單純修復(fù)損傷血管，降低炎癥反應(yīng)程度，這也可能是其效果有限的原因。除此之外，有研究證實(shí)BMSCs對(duì)急性脊髓損傷后活性氧的清除有療效，這也是其發(fā)揮作用的原因之一[15]。通過(guò)清除活性氧，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。綜上所述，Ngb基因修飾的BMSCs聯(lián)合EPO可明顯提高急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，可能與促進(jìn)Ngb表達(dá)有關(guān)。

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熊敏(E-mail： xiongmin1964@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.012

R651.2

A

1002-266X(2016)18-0037-03

2015-12-30)